如何将抗体固定在固相载体表面
03抗体固定化抗体固定化的方式决定了抗体在表面上的取向，这最终影响了抗体的活性。因此，在基于免疫分析的应用中，无论是POCT还是其他方面，抗体的有效固定化需要新颖和精心设计的方法，以确保检测灵敏度的最大化。表6说明了一些抗体固定化的策略的例子。表6|抗体固定化策略
固定化方法的选择依赖于新的化学方法来连接表面功能端基和抗体上的各种自由位置。使用针对抗体上特定氨基酸残基的双功能连接物可以在新的表面化学成分上确定抗体的方向。
从IgG分子中制备片段也有利于使用这种连接剂的方法。
图2说明了使用酶法和重组法产生片段的常见方法，表7强调了一些将抗体固定在多个表面的方法。一般来说，非特异性的方法产生更大的表面密度。然而，有序的方法才会产生更高水平的活性抗原结合能力。
图2|制备IgG片段的方法。
用胃蛋白酶处理IgG分子会产生F（ab'）2，随后用2-巯基乙胺（2-MEA）处理会产生F（ab'）片段。木瓜蛋白酶处理产生Fab片段，它可以与Fc部分分离。重组抗体是一种有吸引力的方法，可以产生卓越的识别元素，包括反应性位点，以促进固定在各种片段上。这些包括单链片段变量（scFv），片段抗原结合（Fab）和单链抗体（scAb），这有利于有序的固定化。
Shmanai和他的同事强调了这样一个事实：抗体的特异性定向能力可能会被抗体上其他低分子量功能与表面的【非特异性】相互作用所掩盖。
因此，必须在位点特异性捕获和非特异性相互作用之间寻求平衡，特别是在疏水性的宏观支持物中。Vikholm-Lundin通过使用含二硫化物的聚合物来解决这个非特异性问题，这种聚合物可以排斥蛋白质，从而阻止任何基于SPR的应用的非特异性相互作用。
表7|抗体的共价固定化方法。
QCM，石英晶体微天平；GOPS，缩水甘油基丙基三甲氧基硅烷；TIRF，全内反射荧光；MOF，微结构光纤；SPR，表面等离子体共振；DDI，直接DNA固定化；PEG，聚乙二醇；SAF，超临界角荧光；DPI，双偏振干涉仪；SAM，自组装单层。
表7强调了将抗体片段（或实际上是一般的抗体）直接连接到平面上的缺点。Brogan和他的同事证明，对于一个大的抗原（碱性磷酸酶，150kDa），立体阻碍导致平面固定策略的抗原结合能力降低。
这可能是由于将抗体直接固定在金表面的限制性，导致变性，但也可能是由于表面嫁接的抗体结合域无法与抗原上的表位结合。
在这种情况下，增加表面密度可能不会增加抗原结合能力，因为固定的片段可能不会与抗原上的表位紧密接触。使用间隔物（如基于葡聚糖的水凝胶或其他三维表面）有利于片段的灵活性和旋转，增加抗原表位和抗体接触的机会（图3）。
图3|平面表面的立体阻碍。
（A）对抗原上不同表位（这里表示为不同形状）具有特异性的多克隆抗体被固定在一个平面上。然而，并不是所有的抗体都能接触到其相对的同源表位进行结合。（B）相反，在水凝胶方法中，有序的固定是可以实现的，但它赋予了潜在的扩展构象，并允许旋转/移动，从而增加了多个抗原结合事件的几率和热衷效应的倾向。
04抗体与量子点的结合抗体与标签的结合也是相当重要的。例如，对使用量子点（QDs）或不断扩大的标记的纳米粒子的兴趣是很大的。
然而，QDs在生理相关的缓冲液中的溶解度较差，连接后的稳定性和抗体功能的保留是对其广泛使用的重大挑战。使用化学连接物对QD进行功能化的研究表明，耦合化学和连接物的类型可能对抗体的功能产生重大影响。
Lee和他的同事们成功地将抗EGFR抗体和长链异功能连接剂（LC-SPDP和sulpho-SMCC）应用于聚乙二醇QD的成像。
虽然主要是针对体外/体内成像，但该方法强调了保持抗体结合的关键方面，选择长链连接物是为了减少对抗体的压力，并保持抗原结合的活性。
将抗体与纳米结构（如QD）结合会带来其他问题，包括将未结合的抗体与制剂分离以及抗体的有序取向。Goldman和他的同事们开发了一种复用的QD。利用蛋白质G的IgG结合域的亮氨酸拉链融合，用抗体对QD进行了功能化。
麦芽糖结合蛋白（MPB）是用同样的白氨酸拉链制备的，并使用淀粉亲和树脂促进了功能化QD的去除。在这种方法中，QD的交联和聚集被最小化，抗体的功能被保留。
对于心血管标志物脑钠肽（BNP），Maeng和他的同事们开发了一种定向scFv安培检测法。酵母中表达的scFv通过HIS标签通过二硫化物-NTA在金表面定向。
在开发的系统中，线性范围似乎在1-10,000 fg mL-1范围内，对于具有商业潜力的便携式系统来说，这代表了灵敏度的重大进步。------------------------------------------------------------------------------End
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