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发表于 2020-5-5 13:40:36 | 显示全部楼层 |阅读模式
再解析:新冠病毒基因组组学特性分析与检测试剂性能的关联性

2019新型冠状病毒于2020年1月12日被世界卫生组织(WHO)命名为2019-nCoV。2020年3月13日,世卫组织将2019冠状病毒疫情从流行病升级为全球大流行病,疫情已在全球广泛传播。

随着分子生物学技术的发展,分子诊断方法成为病原体检测的一项革命性技术。我国在此次疫情爆发之初,就将核酸检测产品及时应用到了疫情防控之中,是新型冠状病毒肺炎(COVID-19)病例确诊的金标准。然而随着核酸检测方法的广泛应用,不断出现的核酸检测假阴性率较高的质疑也成为媒体关注热点。临床学者从标本采集、检测方法、产品稳定性等多方面剖析产生假阴性的可能原因[1]。随着科研人员对新冠病毒基因组的解析,我们对新冠RT-PCR核酸检测试剂的检测性能与其基因组结果特征之间的关联性进行了解析。

2019-nCoV为单股正链RNA病毒,基因组长29.8kb,病毒基因组全长的三分之二是开放性读码框(ORF)。2019-nCoV主要由结构蛋白和非结构蛋白组成,结构蛋白包括E基因编码的包膜蛋白、M基因编码的膜蛋白、N基因编码的核衣壳蛋白、S基因编码的刺突样糖蛋白[2]

国家药监局应急批准的30个新型冠状病毒检测产品中核酸检测试剂19个。



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国家卫生健康委临床检验中心《新型冠状病毒核酸检测室间质量评价结果报告》显示,当前应用最广泛的核酸检测方法是荧光定量PCR法,而获批的实时荧光定量PCR法试剂盒检测靶标主要针对新冠病毒基因组开放性读码框ORF1ab、N基因、E基因保守区域进行引物设计。

1、病毒突变对检测试剂性能的可能影响



前期的研究结果显示新冠病毒传播过程中发生了大量广泛的单核苷酸变异,在最新的李兰娟[3]院士团队的研究结果表明,在对收治的11名新冠病毒感染患者体内分离到的新冠病毒进行了病毒突变情况分析后,统计发现有7株在ORF1ab区域产生12个突变,有2株在N基因区域产生3个突变。核酸检测试剂的引物设计虽通常位于病毒基因组序列的保守区,但经过分析比对发现已知的这些突变不在现有试剂引物相应位置及核酸检测靶标部位。越来越多的病毒基因组变异情况得到证实,那么在进化保守区域是否存在在进化上的保守区域的突变还未可知,若突变位置发生在病毒 RNA的引物设计区域,则可能直接导致检测结果的假阴性。

另一方面,病毒突变也可能对抗体检测产生影响。此项研究同时发现,分离到的11株病毒中在S基因区域有8个毒株产生10个突变,其中一个毒株在S基因区域的突变导致氨基酸发生了改变,而氨基酸变异可能导致其蛋白构象发生改变,且S蛋白是新冠病毒与宿主细胞表面受体结合的主要蛋白。由于结构蛋白发生变异导致患者体内产生针对突变S蛋白的抗体,那么就可能导致现在针对未突变S蛋白的抗体检测试剂检测不到感染者体内产生的抗体而出现假阴性的情况。


2、新冠病毒转录机理对检测试剂性能的可能影响



在对核酸检测假阴性的分析中也多次提到病毒载量对检测结果的影响。实时PCR,就是检测PCR扩增周期每个时间点上扩增产物的量,是通过对扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测,从而实现对起始模板(目的基因)的定量及定性分析。因此反应中病毒载量对应的目的基因含量将直接影响检测结果,而检测试剂的检测限就是检测试剂能检测到的相应反应体系中的目的基因含量,如圣湘生物的新冠检测试剂最低检测限为200copies/ml,即可检测出1ml反应中的最低病毒载量为200copies的病毒。在2020年4月23日《细胞》(Cell)杂志上发表的对新冠病毒的转录组体系结构的研究结果中发现,新冠病毒正链RNA进入宿主细胞后,一方面作为 mRNA指导转录蛋白合成,另一方面通过自身编码的RNA 依赖的 RNA 聚合酶作用生成负链RNA,再以其为模板生成正链基因组RNA完成复制,正链基因组RNA由结构蛋白包装后组装子代完整病毒。新冠状病毒的一个重要特点是其独特的转录策略,新冠病毒基因组RNA还以负链RNA为模板进一步合成亚基因组RNA。新冠病毒转录体中含有大量亚基因组RNA[4],ORF1ab基因由病毒全长基因组转录获得,因此只存在于完整的病毒基因组,只能由病毒全长基因组转录获得,而N基因同时存在于全长基因组和其他亚基因组RNA。那么,在新冠病毒转录过程中,其N基因转录合成量较ORF1ab更高。

对于此项新冠病毒的转录组结构研究,早期也有很多实际验证支持,如韩国学者对于引物探针组的比较分析的一项研究中显示:同样的一个样本,用中国、德国、香港、日本、泰国和美国官方推荐的引物探针进行测评,发现N基因检测结果ct值较其他基因的小3个左右。中国的N基因+ORF1ab的组合,对新冠病毒检测是更为敏感可靠的实验室检测方法[5]

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我国国家药品监督管理局(NMPA)获批的新冠PCR检测试剂中,以双靶标(ORF1ab与N基因)为主,如果单纯检测ORF1ab基因的试剂,对于无症状感染者或康复期类型的病毒载量较低患者,理论上患者体内病毒转录合成ORF1ab基因含量较N基因更低,其检测漏检风险更高,那么从《全国新型冠状病毒核酸检测室间质量评价结果报告》中对低浓度的病毒检出情况也可以印证这个推论。对于低浓度样本(128 copies/mL)能检出的NMPA试剂厂家为圣湘生物及达安基因,均为ORF1ab与N双靶标检测试剂。

核酸检测产品的即时研发和应用,在COVID-19患者的确诊和临床治疗过程中发挥了重要作用,而选择灵敏度高、特异性好、可重复性好的核酸扩增试剂是获得准确检测结果的基础,因此对核酸检测产品的性能及影响因素的关注是非常重要的[6]

观点小结:

1. 新冠病毒在传播过程中发生了大量广泛的变异,现阶段尚未涉及影响到核酸检测试剂的检测性能,但发生在检测目的基因ORF1ab区域及N基因的突变需持续关注;

2. S基因的突变可能导致蛋白构象及免疫原性发生改变,对于抗体检测试剂带来的影响不容忽视;

3. ORF1ab基因仅存在与于全基因组转录过程中,仅针对ORF1ab基因的单靶标核酸检测试剂对低病毒载量样本以及病毒突变株易造成漏检,同时检测N基因及ORF1ab基因的双检测靶标产品能更好的避免检测试剂以上因素导致漏检情况的发生。


参考文献

[1]李振昊,高小玲,杨小娟,徐辉.新型冠状病毒核酸检测分析[J/OL].检验医学与临床:1-5[2020-04-29].http://kns.cnki.net/kcms/detail/50.1167.R.20200317.1710.002.html.

[2] CUI J,LI F,SHI Z L, Origin and evolution of pathogenic coronaviruses[J].Nat Rev Microbiol, 2019, 17(3):181-192.
[3] Hangping Yao, Xiangyun Lu, Qiong Chen, Kaijin Xu, Yu Chen, Linfang Cheng, Fumin Liu, Zhigang Wu, Haibo Wu, ChangzhongJin, Min Zheng, Nanping Wu, Chao Jiang, Lanjuan Li. Patient-derived mutations impact pathogenicity of SARS-CoV-2. medRxiv 2020.04.14.20060160; doi: https://doi.org/10.1101/2020.04.14.20060160
[4] Dongwan Kim, Joo-Yeon Lee, Jeong-Sun Yang, Jun Won Kim, V. Narry Kim, Hyeshik Chang, The Architecture of SARS-CoV-2 Transcriptome. Cell. 2020. https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.04.011.
[5] Yu Jin Jung, Gun-Soo Park, Jun Hye Moon, Keunbon Ku, Seung-Hwa Beak, Seil Kim, Edmond Changkyun Park, Daeui Park, Jong-Hwan Lee, Cheol Woo Byeon, Joong Jin Lee, Jin-Soo Maeng,  Seong Jun Kim, Seung Il Kim, Bum-Tae Kim,  Min Jun Lee, and Hong Gi Kim1. Comparative analysis of primer-probe sets for the laboratory confirmation of SARS-CoV-2. BioRxiv. 2020. https://doi.org/10.1101/2020.02.25.964775doi[
6] 李彩玉,陈梦媛,张师音,葛胜祥.新型冠状病毒核酸检测“假阴性”原因分析及控制要点[J/OL].厦门大学学报(自然科学版):1-7[2020-04-29].http://kns.cnki.net/kcms/detail/35.1070.N.20200402.1421.019.html.
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