伴随IVD行业的发展热浪,越来越多的小伙伴在离开学府后选择投身于IVD事业。其中,IVD试剂研发岗位是大多数刚毕业的小伙伴的首选。作为新人,在刚开始接触研发工作时,各种“花样式”踩坑在所难免。 同样作为一个IVD研发的新人,笔者将结合实际工作中的亲身案例,跟大家分享一下试剂开发过程中,那些常见而又容易被忽视的“坑”。希望对各位刚上路的小伙伴有所帮助。
实验设计
控制变量,你严格执行了吗? 实验设计中,控制变量是确保实验方案/路线正确性的前提。作为新手,在实验中容易忽视对变量的控制,导致试剂优化的过程中因为种种原因造成了设计外变量的出现,使最终的结果无法对问题定位,失去参考价值。因此在实验设计中,在改变某单一实验变量的前提下,需要确保其他变量维持不变,这样才能保证实验结果具备参考性。例如在计划改变磁珠用量时,为了方便也许会通过更改参数来改变加样量,但这样反应浓度就成了计划外的变量,最终结果也失去了参考价值。再比如,评价不同磁珠性能时,却忽略了封闭剂中BSA的批次变化,同样可能会导致结果失去参考价值。因此,在进行设计时,控制变量是我们的第一原则。
对照组,是否被你遗漏? 实验设计中,合理的对照组选择同样十分重要。通常情况下,对照组的选择往往与改变变量的实验组直接对应。因此,在每次实验中,在进行实验组测试的同时,必须同时设立对照组,以确保的结果的可参考性。例如在曾经的一次试剂优化后的测试中,个别样本结果异常,由于没有设立优化前的试剂作为对照,最终导致无法对问题进行精确定位。因此,实验过程中,对照组的设立也是我们能顺利完成实验的必要保证。
应急预案,你是否准备充分?
实验设计中,样本和试剂最好准备双份的量(图1)。在试验过程中遇到的各种问题都会产生损耗,导致最终完成的测试量会少于计划。例如试剂安装可能溅洒、样本被污染、仪器报错需要重新测试、结果异常需要进行复测等。如果此时没有准备好足够的备用试剂,很有可能会因为以外的发生导致整个实验计划泡汤。
溶液配制
溶液配制是整个实验过程中基础的环节(图2),也是每一个研发小伙被的必备基础“生存”技能。然而,在配制中的一些错误很难被直观的观察到,这些错误最终会导致实验结果的异常,例如背景升高、变异系数增大、影响灵敏度等。那么,在溶液配制过程中,又有哪些环节需要我们格外注意呢?
称重的影响因素 为了较大限度地减少称量的误差,有些影响因素是一名新手应该注意的,首先需要正确摆放天平,并排除外部因素如气流的影响,其次,某些物料吸潮的特性也会影响称重结果,因此要确保环境的湿度。称量台账的记录也要准确,便于结果异常时排查原因。
pH的调节的误区 稀释液的pH值和盐离子浓度对于整个反应体系起着至关重要的作用。在pH值调节过程中若加入了过量的酸或碱,即使回调至目标pH值,这时溶液内的盐离子浓度与配方所要求的不一致,若继续使用会导致结果的异常,应重新制备。因此,在进行pH值调节时,应注意酸/碱加入的节奏,避免因为粗心或者心急导致pH“过档”。此外, 有时候pH计响应时间长会导致pH值测值偏差,可以尝试将电极在0.1M盐酸中浸泡过夜去除表面油膜与污物.
溶液的污染 溶液中的细菌也可能会引起结果异常,因此可根据反应体系选择合适的抑菌剂。同时,在试剂配制后也要用微孔滤膜滤去细菌,同时在微孔滤膜的选择上要考虑到溶液的蛋白含量。使用抽滤器进行过滤后,会有部分蛋白残留在过滤器中,由于结构复杂,简单的冲洗并不能完全将其去除。例如有一次在将微球加入新配的缓冲液后立刻发生了聚集,经过排查后发现是溶液的问题,在过滤前未能清洗干净过滤器,其中残留的蛋白混入了微球缓冲液,最终导致微球的聚集。因此,对于溶液配制过程中“污染”控制,也是溶液配制的关键考量因素。
移液的误差 在试剂配制时特别是配制校准品时要注意移液器吸头外壁的液滴(图5),校准品的原液浓度往往很高,在配制过程中会进行千倍的稀释,在吸头内仅有几微升的情况下,吸头外壁的抗原会使校准品浓度显著升高,导致配制的溶液浓度出现较大偏差。因此,在使用移液器进行操作时,需要对这些细节格外留意。此外,移液器的定期校准从而保证移液量的准确,也是必不可少的。
上机实验
余量监测 目前我们平台所使用的化学发光仪在余量计算上有两种方式,一种是直接使用探针探测,这种探测方式优势在于试剂余量不足时项目会自动停止检测,但试剂会存在部分死体积,并且不同仪器之间存在差异,因此在试剂配制量上要计算额外的体积。另一种是输入试剂量,用于激发液余量,由于输入的量与实际体积会存在一定误差,并且激发液置于仪器内不便于观察,可能会出现空吸的情况,最终造成结果异常。因此,为了确保加样量的准确,对工作液余量必须得到保证。
异常样本排查 作为新手我在刚接触工作时,样本的类型经常被忽视,由于部分样本纤维蛋白较多(图6),若不在上机前进行离心,在进样时可能会造成仪器堵针,导致加样量不准确,甚至损坏仪器。部分样本在多次冻融后也会出现上述情况,需要留意。因此,为了实验的顺利进行 ,样本状态要注意观察。
试剂检查 化学发光仪在测试前虽然会进行试剂混匀的操作,但那些放置多天的试剂会出现磁珠沉淀在底部的想象,仪器的混匀过程并不能保证磁珠均匀分散,因此,为了确保磁珠的浓度一致,在加载试剂前最好手动混匀试剂。
加样间隔 化学发光平台是由仪器全自动加样,但侧向层析平台是人工加样,受限于仪器读取发光值的时间,如果加样间隔过短,各试剂条最终的反应时间不同,会影响信号值,因此,为了确保反应时间的一致,需要计算出合适的加样间隔。
结果分析
实验结果最初是以信号值这一形式展现在大家眼前,在初次面对这些数据时我也常常会忽视其中的一些信息,没有及时对异常数据进行复测,从而使部分信息失去参考价值,并增加了额外的工作量。
异常结果的处理 在处理结果时,经常会遇到一些与预期不符或者明显异常的数据。面对上述问题,首先应当抱着“自我怀疑”的态度,从自身因素进行排查。如根据实验记录确定工作液等是否配制正确,逐步排除可能的因素,对问题进行定位,来保证本次实验数据的准确性。此外,一些显著异常的数据,可能是试剂“跳值”或者加样针漏加样本等因素所导致,可以通过复测该类问题进行排除。同时,对于一些复测后仍然异常的样本,还可进行对倍稀释复测的方法,来对干扰/特异性的问题进行定位。
解放思维 作为一名新人在面对数据时,往往会产生“隧道效应”将注意力集中在隧道的出口--本次实验的目的,从而忽视了数据中其他的不明显的变化,例如在对试剂稳定性的优化中,除了考察不同条件下的稳定性,也可以分析不同的条件是否会对其灵敏度带来提升,将思维放宽后,同一组数据有时也许会带来意料之外的收获。 |