前言
自从上世纪70年代提出ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）技术以来，ELISA已经渗透到各种科学研究中，并成为生物医药研发领域不可或缺的经典技术。ELISA是一种强大的免疫测试方法，通过酶反应催化来表现抗原抗体结合的定量分析，又叫EIA（enzyme immunoassay），被用来鉴定肽，蛋白，抗体以及激素等等1，过去数十年凭借较高的灵敏度与高通量性一直坐稳治疗性抗体药物定量分析的“头把交椅”，也是行业公认的“金标准”。
Fig.1 ELISA
这项技术以96孔板的形式被许多公司开发成试剂盒，如Thermo Fisher，Sigma，Boster以及Abcam等等，孔表面包被有特定的捕捉抗体或抗原来结合特异性的分析物，待加入底物后，发生催化反应产生特定的荧光信号来检测分析物的水平，形象的说就是一只先头部队找到了目标之后，信号兵释放信号弹通知成功找到目标的过程，随着抗体药物在全球的大规模上市，癌症以及自免疫疾病等患者看到了生命延续的曙光，同时ELISA技术的不断进步也将自己推上了顶峰，截至2017年，据Zion Market Reseach数据表明，ELISA在全球的销售额已接近5亿美元，并预估逐年以4.6%的速度增长，在2022年达到5.47亿美元2。
Fig.2 Zion Market Research Analysis
历史发展ELISA的发展起点要追溯到RIA（radioimmunoassay）的历史，Yalow和Berson在1960s第一次使用碘标记的RIA技术来测定内源血浆中的胰岛素水平3，然而放射性实验安全风险太高，不适合进行大面积推广应用，这时候一些科学家便想用生物酶来代替放射性标记，但如何将酶与抗体或抗原连接而不影响彼此的生物活性成为了必须要捅破的窗户纸，尽管在当时被普遍认为是不可能的实验，Perlmann和Schuurs 还是在1966年力证了酶连接的免疫试验是可行的，直到1971年，Perlmann和Schuurs两个研究组几乎同时发表了ELISA的文献，向世人系统性的介绍了ELISA的方法4，此后，ELISA经历迅速的，直接开启了商业临床和医疗诊断的应用。
Fig.3 ELISA 作用图
ELISA的类型目前酶联免疫吸附测定使用的最多的是检测特异性的抗体或可溶性的抗原，因被检测的物质可分为多类，且每次的结构与特征都不相同，所以为了提高灵敏度开发了不同类型的ELISA方法，主要分为四种：
Fig.4 ELISA方法的四种类型
Direct ELISA法：这是Perlmann最早建立的ELISA方法，通常用于检测分子量比较大的抗体或抗原，以及抗体筛选和抗原表位作图，这个模式比较简单，将抗原包裹在孔中，加入酶连接的特异性抗体，靶向固定化的抗原，成为牢固的复合体，洗去结合不紧密的抗体或背景蛋白后，加入合适的底物量，孵育使其发生特定的酶反应催化，产生显色反应，通过检测荧光信号来定量分析物。
Fig.5 Direct ELISA
Table 1 Direct ELISA方法优缺点比较
Indirect ELISA
由于受到direct ELISA方法的鼓舞，Lindström和Wager在1978年发表了indirect ELISA方法5，之所以叫indirect ELISA方法，是因为相对于direct ELISA，它引入了第二个抗体来进行检测，与direct ELISA不一样的是，它通过使用一抗能结合多个二抗，从而放大了检测灵敏度，就好像在一个黑暗的房间，direct ELISA只有一个50W的灯泡，而indirect ELISA能接上两个50W的灯泡，这样房间的亮度是不一样的。
Fig.6 Indirect ELISA
Table 2 Indirect ELISA方法优缺点比较
Sandwich ELISA这项ELISA技术是最受欢迎的，1977年，Kato和他的同事发明了这项结合direct与indirect ELISA 技术特点的经典方法6，“sandwich”最明显的特点就是特异性高，灵敏度高，试想去分辨身高长相完全一致的双胞胎，你只熟悉并想找到其中一个人，然而单靠肉眼已经无法做出最正确的判断了，这时候需要听他们各自的声音便来区分。Sandwich ELISA将一抗固定在孔表面，含目标抗原的测试样被加入到孔中使其充分结合抗体，待洗去未结合的杂质后，加入酶标记二抗结合抗原的另一表位，形成“sandwich”的结构，这时候的抗原就像被两个面包片夹着的奶油，通过酶催化发生显色反应就可以测定抗原的含量。
Fig.7 Sandwich ELISA
Table 3 Sandwich ELISA方法优缺点比较
Competitive ELISACompetitive ELISA方法是所有ELISA里最为复杂的测试方法，它是一种检测干扰信号的强度来反应样品中的抗原水平7，通常以酶标记的抗原作为竞争抗原，与样品来源的抗原分析物形成直接竞争，抢夺过量的固定化抗体上的结合位点，因此干扰信号越高，说明样品中的抗原越少，这跟“占坑”的理念是一致的。 Fig.8 Competitive ELISA
Table 4 Sandwich ELISA方法优缺点比较 总结
ELISA试剂盒给测定不同生物流体样品中的抗原或抗体含量提供了极大的便利，可选择度高，使用起来也非常简便，兼顾高灵活性以及高灵敏度。根据最新的研究统计表明，尽管受到COVID-19的影响，ELISA全球销售额的增长速率仍将在2020年会发生显著的改变8，并逐年增长，我们非常欣喜的看到这项技术仍在不断进步，其销量攀升的同时，我们也在目睹生物医药的强势崛起，未来必将造福更多的全球病患。
参考文献 1, Aydin S. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA[J]. Peptides, 2015: 4-15.
2.https://www.zionmarketresearch.c ... ssay-testing-market
3. Yalow R S, Berson S A. IMMUNOASSAY OF ENDOGENOUS PLASMA INSULIN IN MAN[J]. Journal of Clinical Investigation, 1960, 39(7): 1157-1175.
4. Engvall E,Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitativeassay of immunoglobulin G. Immunochemistry 1971;8:871–4.
5. Lindström P, Wager O. IgG autoantibody to human serum albumin studied by the ELISA-technique. Scand J Immunol 1978;7:419–25.
6. Kato K, Hamaguchi Y, Okawa S, Ishikawa E, Kobayashi K. Use of rabbit antibody IgG bound onto plain and aminoalkylsilyl glass surface for the enzyme-linked sandwich immunoassay. J Biochem 1977;82:261–6.
7. https://www.differencebetween.co ... ncompetitive-elisa/
8, https://www.marketsandresearch.b ... nked-immunosorbent-assay-elisa-market-growth-status-and-outlook-2020-2025#table-of-figures
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发表于 2020-7-28 08:26:56
