体外诊断：常见核酸提取纯化方法

admin

目前，新冠疫情在全球席卷开来，对于如何确认是否感染，使用体外诊断核酸检测方法仍是不可或缺的手段。

体外诊断，是指在人体之外，通过对人体样本(血液、体液、组织等)进行检测而获取临床诊断信息，进而判断疾病或机体功能的产品和服务。

而检测人体样本的关键步骤之一，即是样本中的核酸（DNA和RNA）纯化。核酸纯化的方法是影响所提取核酸质量的重要因素，只有高质量的核酸才能满足下游的各种应用。

核酸是分子生物学的基础，而核酸提取是核酸检测，乃至于整个分子行业绕不过去的门槛，很多时候一份样本的核酸提取的好坏直接决定了检测结果的有效性。

（一）核酸的基础知识

核酸分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），其中RNA又可以根据功能的不同分为核糖体RNA(r RNA)，信使RNA（m RNA）和转移RNA（t RNA）。

DNA主要集中在细胞核内，线粒体和叶绿体中，而RNA主要分布在细胞质当中。

（二） 为什么需要核酸提取？

核酸提取为大量广泛研究和应用提供了答案（例如：克隆、qRT-PCR和全基因组、转录组范畴中的二代测序技术），获得的核酸可以多种方式进行应用。

准确的研究目的，决定了要提取的核酸类型；核酸的应用往往影响提取方法的选择。（例如：标准的End-point PCR反应，不需要与全基因组测序实验相同的DNA质量）

为了确定最佳的研究方法，有必要清楚了解核酸的下游应用以及任何与样品类型相关的潜在限制。（例如，临床样品采集量往往有限，核酸提取存在挑战。）

虽然依据样品类型，细胞裂解方式不同，但整体的核酸提取核心原则不变：细胞或组织样品裂解，去除非核酸污染物（例如，蛋白质等）。

（三）核酸提取纯化原则和要求

1、保证核酸一级结构的完整性

2、排除其它分子的污染（如提取DNA时排除RNA的干扰）

3、核酸样品中不存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；

4、其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到最低程度；

5、排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时应去除RNA，反之亦然。

（四）常见核酸提取纯化方法

1、苯酚氯仿抽提法

苯酚氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，变性降解核蛋白，使DNA从核蛋白中游离出来。而DNA易溶于水，却不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。利用萃取原理，根据蛋白核酸溶于不同的试剂层，将枪头伸入不同液层内抽取所需的成分，经多次洗涤后获得纯化核酸。

缺点是由于使用了苯酚、氯仿等试剂，毒性较大，长时间操作对人员健康有较大影响，而且核酸的回收率较低，损失量较大，由于操作体系大，不同实验人员操作重复性差，不利于保护RNA，很难进行微量化的操作。

优点是采用了实验室常见的试剂和药品，做起来成本比较低廉。

2、 离心柱纯化

此种方法是利用核酸表面会覆盖一层由水分子构成的薄膜，在高盐环境下，这层亲水膜会遭到破坏从而核酸可被吸附在离心柱上，而其他杂质如蛋白质、代谢产物等则会被离心沉淀与核酸分离。最后通过洗脱，将核酸从吸附膜上脱离，即可得到纯化后的核酸。离心柱纯化也是的试剂盒提取中广泛的使用方法。

但即便如此，离心柱纯化法仍存在缺点：

高度依赖吸附膜的结合能力；

洗脱不完全导致核酸流失；

无法大量提取核酸。

离心柱纯化法示意图

3、磁珠法核酸分离技术

携带正电荷的磁珠易于吸附负电荷的核酸，主要用于从人血清或血浆样品中提取DNA 和RNA（例如从血液样本中检测HIV 或HBV 病毒基因组的样品制备）。一般而言，将样品与结合缓冲液和磁珠混合，核酸与磁珠结合后，经过数次洗涤与磁场捕获，洗脱下来的核酸即可通过PCR 或其它特定方法来检测特定的DNA或RNA。磁分离法也是广泛应用于诊断行业，且能实现高通量、自动化的核酸提取方法。

磁珠法提取示意图

不同类型基因检测均会涉及到核酸的提取和纯化步骤。核酸提取纯化的方法中，液体法和离心柱法均会涉及到有毒有机物的使用，对环境和实验操作者均存在一定的危害。而磁珠法需要相应特殊配制的磁珠缓冲液和特异修饰后的磁珠，从成本和操作方面来分析，均存在成本高且操作步骤繁琐，同时，也限制了自动化的进程和应用的推广。因此，开发一种能快速释放核酸并且对后续基因检测实验无影响核酸快速释放方法成为目前亟待解决的问题。

4、基因核酸快速释放技术

DNA释放试剂盒，专用于从各种常见的样品中快速释放恒温荧光扩增的 DNA，具有以下特点：

1. 核酸释放剂可以快速裂解样品，使样品的 DNA 游离在溶液中。无需自备任何试剂，不使用苯酚、氯仿等有毒试剂。

2. 操作简单，只用一步（约 3min）即可得到用于恒温荧光扩增的 DNA 模板，不需要任何离心、抽提等操作步骤。

3. 全过程仅在一个离心管内完成，避免微量样品的损失，且不容易交叉污染，比常用的抽提试剂盒简单，方便。

4. 兼容性广，适用于常见的分子生物学样品，包括细菌、昆虫、各种动物组织、口腔细胞、毛发、组织中的细菌和病毒等。

DNA释放剂使用方法

应用领域：

生命科学研究、分子诊断、动物疫情检测、食品安全检测、疾控/突发传染病检测、精准用药基因检测

------------------------------------------------------------------------------

​End

1700人QQ大群，欢迎加入

1号QQ群：140978441

2号QQ群：951835987

490人微信大群，欢迎加入

群主微信号：1678200596

抗体世界：www.ivdab.com

IVD原料论坛：www.BBSivd.com

IVD原料世界--微信公众号