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摘要
在无数应用中，抗体仍然是非常有用的，包括基础研究、成像、靶向传送、色谱、诊断和治疗。在生产阶段,抗体一般都存在于复杂的细胞中，而且它们的大部分应用都需要纯化后使用。由于终产品的高质量需求和工艺高成本，抗体纯化一直是下游处理的一个主要瓶颈。多年来,广泛研究的重点是寻找更好的纯化方法来克服这一问题，在多种不同的技术中，亲和层析是纯化抗体最具选择性、快速和容易的纯化方法。本评价旨在提供亲和层析的详细概述和涉及到的纯化的步骤， 详细介绍一系列介质基质以及亲和力配体的工作原理，在纯化不同类型抗体时，每种介质的局限性和优点；以及最近的发展和优化纯化工序的重要实践方法考虑讨论。
 主要内容： 1、介绍 2、亲和层析：原理 3、亲和色谱：组成 3.1、介质基质 3.2、亲和配体 3.2.1、生物特异性配体 3.2.2、假性特异性配体。 3.2.3、合成配体 3.2.4、亲和标签 4、亲和层析：实际考虑问题 4.1、样品准备 4.2、吸附 4.3、洗涤 4.4、洗脱 5.结论和未来展望
1、介绍抗体是宿主免疫的诱导型防御成分，免疫系统识别并中和非自身物质比如病原体。抗体是免疫系统特定组分，免疫系统不仅直接消除外来颗粒，也触发其他非特异性效应子功能，例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，补体依赖性细胞毒性和抗体依赖性细胞介导的吞噬作用，以消除对宿主的威胁。
抗体以免疫球蛋白G（IgG）分子为代表，它是在哺乳动物血清中发现的最丰富的子类。由于IgG在提取和纯化过程中相对较小的尺寸和稳定性，它在分析开发与基于抗体的疗法中有广泛的应用。
IgG由四个多肽链组成，两条重链和两条轻链通过二硫键连接的Y形结构（图1）。这些重链和轻链是基于其分子量的差异而命名。轻链具有约25kDa的分子量，而重链具有约50kDa的分子量。基于氨基酸的变异性，重链和轻链进一步分为恒定区（C）和可变区（V）区。恒定区确定用于破坏抗原的机制，并根据其类型和免疫功能将抗体分离成五大类（IgM，IgG，IgA，IgD和IgE）。可变区域进一步细分为高变量区（HV）和骨架区（FR）。
相对保守的氨基酸序列组成FR区。反过来，在HV区域（也称为决定簇互补区（CDRs））中的氨基酸序列中存在大量的变异性。CDR中不同氨基酸的组合赋予抗体识别特异性抗原决定簇（表位）的能力。在重链和轻链中，有三个HV / CDRs通过四个FR区彼此连接。功能上，构成抗原结合片段（Fab），负责与抗原的特异性结合与片段结晶（FC区域），这对感应器的机制很重要，特定识别宿主免疫系统的非特异性效应机制（图1）。
抗体被分为多克隆，单克隆和重组形式。多克隆抗体是对于某一抗原，B细胞产生的抗体的混合物。这样一个混合物包含有不同亲和力的抗体和不同的特异性抗原表位。单克隆抗体生产从单一的B细胞克隆体中，有单一的抗原决定位特异性。产生的抗体或抗体片段在试管中使用分子技术被归类为重组抗体。
抗体正在越来越多地被开发使用，因为他们具有明显的好处。不断被用于各种科学研究工作，包括但不限于基础研究，色谱分析，靶向分析，成像，诊断和治疗。这些应用大多数需要高纯度的均匀抗体。因此，对于来自复杂混合物（例如血浆，血清，腹水，细胞培养基，蛋黄，植物提取物和细菌或酵母培养物）的抗体的纯化，这对于简单、有效和经济的纯化方法的需求不断增加。为了达到这个目的，测试了基于不同纯化原理的方法（如大小，溶解度，电荷，疏水性和结合亲和力）。然而，由于亲和层析法特异性、易于操作、相对高的收率和处理量等特点，使其成为最有效率和广泛使用的层析技术。
图1 典型免疫球蛋白IgG的结构。IgG是大约150-155kDa的大分子，含有由不同结构域组成的2对重链和轻链。重链由可变结构域（VH）和三个恒定结构域（CH1，CH2和CH3）组成。两个重链通过铰链区中的二硫键（SS）连接。轻链具有一个可变结构域（VL）和仅一个恒定结构域（CL）。
2.亲和层析：原理亲和层析是液相层析方法中选择性和通用性最好的技术，依赖于蛋白及其配体的可逆性定点结合，如激素与其受体，酶与其底物，抗体与抗原等。可以利用这种特异性的相互作用，将相互作用物质中的一相，被称为亲和配基，固定到柱子上作为固定相来进行亲和层析。通过亲和配基的选择性吸附，目的蛋白从复杂组分中洗脱出来。包含目的蛋白的复杂组分，加载到具有适宜的缓冲体系和pH值的层析柱上，使目的蛋白结合亲和配基，而其他组分直接流穿。然后目的蛋白可以从层析柱上洗脱下来，洗脱方法根据目的蛋白和配基相互作用的性质而定。洗脱完毕后，层析柱再生，用于下一个样品。
3. 亲和层析：组成亲和层析可以选择多种不同类型的结合剂（配基）和固相支持物（基质），通过优化不同的属性，如特异性，选择性，可重复性，交联化学，成本有效性等，亲和层析可以用来大规模地纯化抗体，获得想要的产率和纯度。多年以来，不断努力发现和制造高质量的介质和配基，辅以优化有效的亲和层析方法，来达到以经济有效方法产生越来越多高纯度的目标抗体。
3.1
层析介质 亲和层析首先需要一个目标蛋白和配基的支持系统。早期的层析方法利用天然的物质作为支持物和结合配基，主要是在酶的纯化过程中，例如用不溶性淀粉纯化淀粉酶，多聚半乳糖醛酸酶纯化海藻酸，麻仁球蛋白晶体纯化胃蛋白酶，麻仁球蛋白纯化弹性蛋白酶。随着需要纯化的生物分子越来越多，但是天然来源的配基和支持系统一直受限，因此需要从其他来源获得支持物质。这些支持物质需要满足如下特征：最小的非特异性吸附，在使用的缓冲液系统中不可溶，能够耐受合适的流速，足量的表面区域，易于活化后连接配基。另外，这些支持物质必须在柱子里均匀分布，具有大孔径，亲水性，在不同的化学物质和机械压力下仍然稳定。
为了获得一种理想的介质材料，试验了不同的支持物和交联化学物质。1936年，Landsteiner 和van der Scheer 用重氮基偶联方法来偶联半抗原到鸡红细胞基质上。1951年，另外一个研究组使用激活的纤维素将BSA固定，从BSA免疫过的小鼠血清中分离抗BSA抗体。随后，一些基团作为结合剂偶联到固相介质如多聚氨苯乙烯和玻璃珠上用来纯化酶或者抗体。然而，两个突破性的发现改变了层析介质的发展方向。首先是1964年发现了琼脂糖颗粒，随后于1967年发现了CNBr固定化方法，这项技术进步可以很方便地将肽或蛋白共价偶联到多糖基质材料上。
CNBr偶联法在亲和层析上有诸多应用，然而，由于其有毒性，会对使用者身体健康造成威胁，又发展了一些其他的偶联剂如碳二亚胺，三氟代乙烷磺酰氯，戊二醛，磷酰氯。但这些偶联剂的激活仍然是个问题。因此，预激活的介质发展起来并开始商业化使用。这些预激活的介质使用包括伯胺、硫氢基、醛类、氢氧根、羧酸在内的化学物质作为偶联配基共价交联到基质上。根据化合物的来源，用于亲和层析的介质分成三类：天然的，合成的和无机的。
在过去的二十年，基于磁珠的亲和分离获得了越来越多的关注，自从上世纪70年代以来，生物相容的磁珠在化学、医学和生物科技上获得了越来越多的关注。早期发表的一篇综述详细描述了磁珠在蛋白质和肽分离纯化上的应用。基于磁珠和适宜的配基偶联的纯化技术可以很简单地将磁珠和包含目的抗体的样品混合孵育。结合有抗体的磁珠可以通过离心捕获，随后洗涤，洗脱获得结合的抗体。磁珠方法简单，快速，有较少苛刻条件，适用于高蛋白浓度的样品。因此，磁珠方法经常用于高通量的自动操作。为了制备磁珠支持物，磁珠粒子先用多聚物包裹，生物分子能连接到该多聚物上。不同种类的物质如聚乙烯树脂，琼脂糖，纤维素，硅胶和多孔玻璃能够包裹不同尺寸的磁珠粒子。由于低成本和稳定性，磁珠获得了广泛应用并有不同形式的商品化产品。
前述提到的层析基质能被加载到柱子中，然而，相对高的成本和高的压力使之在某些特定领域并不受青睐，另一种选择性的大蛋白生物分离方法为亲和膜。亲和膜具有优良的传质效率，易于操作，大孔隙，大表面积和高的动态结合载量，由于紧实，亲和膜有不同尺寸和配基形式，易于放大。亲和膜的应用与上述介质类似，也是偶联亲和配基的膜被激活，然后用来捕获抗体。亲和膜广泛用于高通量的应用，并且溶胀凝胶已有商业化的产品。
表1 用于亲和层析的不同基质 | | | | | | 葡聚糖 | 葡聚糖 | 纤维素珠 | 纤维素珠 | 化学合成 | 丙烯酰胺 | 生物凝胶 | 聚苯乙烯 | 聚苯乙烯 | 聚甲基丙烯酸甲酯 | 分离HEMA | | 多孔二氧化硅 | 多孔二氧化硅 | 玻璃纤维 | 玻璃纤维 | | |
3.2
亲和配体 亲和配体是亲和层析装置的主要组成部分。用于亲和层析的合适配体的典型特性包括对靶的亲和力，特异性，固定可行性，在苛刻洗涤和洗脱条件下的稳定性，以及在附着到基质之后保留靶结合能力。已经进行了大量研究来开发和修饰这些配体以改进蛋白质纯化。然而，这些配体只有少数已经发现抗体纯化的一致用途。这些配体分为三大类：生物特异性配体，假性特异性配体和合成配体。此外，重组亲和标签用作纯化重组抗体的替代配体。
3.2.1 生物特异性配体 生物特异性配体是天然衍生的分子，通常具有高抗体结合亲和力。该类包括生物来源的抗体结合蛋白，例如细菌衍生的蛋白质，抗原，凝集素和抗体。生物特异性配体具有高特异性和选择性的特点。
3.2.1.1细菌衍生的蛋白质 细菌衍生的蛋白质对抗体具有高亲和力，因此是抗体纯化的主要工具。其中，蛋白A，G和L是用于纯化全长抗体的最常用的配体。蛋白A从金黄色葡萄球菌的细胞壁分离，由5个IgG结合结构域（称为E，D，A，B和C）组成。蛋白A在其CH2和CH3结构域之间的连接处与IgG的Fc区结合，与VH3家族的CDR2和CDR3之间的重链可变区结合。从C和G组的链球菌属分离蛋白G。并强烈结合IgG的Fc区，并且与Fab区的CH1结构域具有低亲和力。
除了IgG之外，蛋白G还与白蛋白，a2巨球蛋白和激素结合，这导致纯化效率的降低。蛋白A和G均与来自不同物种的抗体结合，基于其亚类和来源具有不同的亲和力（表2）。蛋白A仅与某些物种和抗体亚类结合；蛋白G是广谱的，具有低的结合能力，在苛刻的洗脱步骤中不稳定。多年来，开发了重组工程形式的蛋白A和G，克服了它们的缺点。例如，开发了遗传工程改造的蛋白A和G融合蛋白，结合蛋白A和G两者的IgG结合结构域。该融合蛋白结合所有人IgG亚类（表2）。
从Peptostreptococcus magnus分离的蛋白L是另一种可用于抗体纯化的细菌蛋白质。蛋白L对抗体可变区的κ（k）轻链具有纳摩尔亲和力。虽然它只绑定到j1，j3和j4子类的抗体轻链，不识别j2和k亚组，因此具有结合不同抗体亚型（IgG，IgM，IgY，IgD和IgE）的能力（表2）。
3.2.1.2凝集素 凝集素是与抗体上的糖基化位点特异性和可逆结合的碳水化合物结合蛋白，使得它们可用于抗体纯化。用于抗体纯化的一些常见凝集素包括刀豆素A（Con A），小麦胚芽凝集素（WGA），甘露聚糖结合蛋白（MBPs）和茉莉酸。ConA从Canavalia ensiformis中分离，与D-甘露糖和D-葡萄糖结合，小麦胚芽凝集素（WGA）结合唾液酸和含有N-乙酰基-D-葡糖胺残基的分子，MBP 从哺乳动物血清中分离，结合甘露糖和N-乙酰基-D葡萄糖胺残基，从木菠萝Artocarpus integrifolia分离的jacalin结合D-半乳糖基。凝集素适用于IgD，IgA和IgM纯化，否则难以使用细菌衍生的配体进行纯化。
3.2.1.3抗原和抗体作为配体 可以使用全部抗原或特异性肽作为配体来纯化抗原特异性抗体。或者，也可以利用模拟抗原结构或序列的配体。这种方法导致选择具有不同亲和力的抗体，尽管需要基于待纯化的抗体的亲和力进一步优化洗脱条件。类似地，抗体还提供用于抗体纯化的高特异性选择。抗体的恒定结构域用作该过程的潜在靶标。然而，抗体在极端pH和高盐浓度下会有稳定性问题，通常需要洗脱，导致抗体从柱中穿出。单结构域抗体（sdAb）特别适用于抗体纯化，因为它们具有小尺寸、高亲和力、稳定以及能够结合新表位的三维结构。此外，sdAb可以使用微生物系统进行大规模生产，并且可以根据目标的类型调整特异性和亲和力。然而，sdAb是单体的，因此在纯化过程中其结合能力有限（由于它们的单价）。
由于生物特异性配体的特异性和选择性，它被广泛用于纯化抗体; 然而，生物特异性配体也有很多缺点，使它缺乏吸引力。它的制造和加工费用昂贵而费力。与生物特异性配体相关的其他缺点包括稳定性差，批次间的差异性，高污染和毒性风险，配体泄漏，消毒困难，结合能力低，寿命周期有限和放大电位不足。另外，由于它们的大尺寸，它们难以固定在适当的取向上。因此，定期研究替代配体来克服这些限制。
3.2.2假性生物特异性配体 假性生物特异性配体是一组替代配体，利用免疫球蛋白的固有特性，因为它们是以参与免疫球蛋白与亲和配体的多种非共价力的相互作用而开发的。这些配体是有希望的候选物，因为它们更便宜，稳定，毒性更低，结构良好，并且高度稳定，因为它们符合严格卫生和灭菌条件的药品生产质量管理规范（GMP）的标准。它们的亲和力相对低于生物特异性配体，但足以确保靶向抗体的特异性和选择性。抗体纯化中使用的一些最常见的假嗜性特异性配体包括嗜酸性，羟基磷灰石，L-组氨酸，螯合金属离子和混合模式配体。用于纯化抗体的假嗜性特异性配体的开发在九十年代初开始，从那时起，几种产品如Thiosorb，T-gel，HAUltrogel和MEP HyperCel被商业化并被广泛使用。
3.2.2.1 紫外吸收色谱（TAC） TAC是基于免疫球蛋白与硫醚取代的有机砜化合物结合的特异性倾向，该反应称为亲硫作用。TAC基于合成假性亲和基质的使用，称为嗜碱性凝胶（T-gel）。T型凝胶是最常用的吸附剂，吸附仅取决于存在的一种去离子性盐。通过二乙烯基砜和2-巯基乙醇反应合成T-凝胶，固定化配体的化学式为琼脂糖-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-SCH2-CH2OH ，表明存在具有两个硫原子的直链配体。硫原子提供了高盐浓度下免疫球蛋白选择性结合的特异性。
由于其小尺寸和高电荷密度，磷酸盐和硫酸盐是在TAC中采用的最常用的缓冲体系。缓冲系统的组成根据氢键的自由能或基于Hofmeister序列的经验确定，以避免在高盐浓度存在下蛋白质沉淀。可以通过降低盐浓度来洗脱结合的免疫球蛋白，然而，用于洗脱不同抗体形式的盐浓度需要优化，以实现其最纯形式的抗体的最高回收率。Boschetti已经在其他地方审查了一系列嗜硫性配体。
在盐浓度、基质的化学稳定性、高蛋白结合能力和对几类抗体的亲和力的吸附行为的简单易控，使TAC成为多种应用中的一种选择方法。已经发现硫代色谱法可用于纯化来自奶牛的IgG 、小鼠杂交瘤、来自人和兔的IgG 。来自蛋黄的IgY ; 来自大肠杆菌的F（ab’）2 ; 和Fab片段和scFv 。
除了盐依赖性的嗜硫配体外，还报道了不依赖于盐具有较高捕获IgG能力的巯基杂环配体 。例如，Qian等合成的嗜硫磁性聚合物珠，其被发现以不依赖于盐的方式对IgG具有强的特异性。磁珠通过使用2-巯基烟酸（MNic）的杂环配体进行官能化。通过与二乙烯基苯（DVB）和乙酸乙烯酯（VAc）的微悬浮聚合制备珠粒。通过使用这些珠粒，作者能够在分批模式和生理条件下，借助磁性倾析纯化人血清，获得纯度> 94％，生物活性> 99％的抗体。
3.2.2.2 羟基磷灰石层析（HAC） 羟基磷灰石（HA），（Ca5（PO4）3OH）2是天然存在的化合物，其合成形式可作为钙和磷酸盐化合物以及替代氟磷灰石（FA），（Ca5（PO4）3F）2。HA用作多孔陶瓷微球以产生混合模式树脂。HA通过以下几个位点介导相互作用（i）P位点 包含三个磷酸基团，每个磷酸基团具有一对带负电荷的氧残基与蛋白质的氨基相互作用，类似于阳离子交换剂; （ii）C位点 具有2个带正电荷的钙， 通过羧基簇介导钙螯合蛋白质，通过磷酰基对DNA进行钙配位，机制为金属亲和类型。
P位点和C位点的结合是相互协助的；与抗体结合，与其他溶质不结合。传统的洗脱策略包括使用磷酸盐或氯化钠梯度；然而，最近也采用了硫酸盐和硼酸盐梯度。据报道，HAC在IgG的一步纯化中的应用与蛋白A和蛋白G同样有效。还采用HAC方法支持IgA 和IgM 捕获，容量范围为10-20mg / mL，产率为90％纯度。HAC在工业规模生产过程中的应用是去除抗体聚体。在这些应用中，推荐使用聚乙二醇（PEG）。PEG增强聚集体去除，因为它对HA具有二次尺寸选择性。当与氯化物梯度一起时，添加PEG被认为是最有效的，因为它有助于更好地去除宿主细胞蛋白质，滤去蛋白质A，DNA，内毒素和病毒。
3.2.2.3 疏水电荷诱导色谱法（HCIC） HCIC方法基于依赖pH的方式使用双模式可离子化疏水配体。由于蛋白质结合在几乎中性的条件下，所以该方法对抗体纯化来说是在近似生理条件的环境下进行的。嗜硫色谱和羟基磷灰石色谱均需要高盐浓度;而HCIC仅需要pH值的变化，因为流动相的pH改变配体和吸附其上的抗体所带的净电荷，导致静电排斥诱导的解吸附。4-巯基乙基吡啶（MEP）通过疏水间隔臂连接到亲水基质上，是选择性吸附抗体的双重配体。MEP上吡啶环的存在为免疫球蛋白的分离提供了优势。
当样品在不调节离子强度或pH值时，pH值7-8（生理pH）时的IgG动态结合能力为25至35 mg / mL。在中性条件（pKa 4.8）中为非电荷结构的MEP与抗体有效结合;并且在流动相的酸性pH（4.0-4.5）下，在配体和结合的靶分子上均带净正电荷，导致由于吸附剂和带正电荷的抗体之间的排斥力而使抗体解吸。由于该方法简单，在一步操作中实现了纯化和浓缩效果。MEP的化学性质使其呈惰性，因此不与样品的杂质相互作用；增加流穿液中杂质的清除。综合来看，HCIC是从各种来源的样品中纯化抗体的有效方法，如动物血清，腹水和细胞培养上清液。
3.2.2.4 固定金属亲和层析（IMAC） 在IMAC中，金属离子作为亲和配体，其与附着于载体的螯合剂结合。蛋白质的吸附是基于位于蛋白质表面的电子供体基团与固定的金属离子之间的相互作用。存在于生物分子的外表面上的氨基酸部分如组氨酸，半胱氨酸，丝氨酸，谷氨酸，天冬氨酸和色氨酸在其氨基末端或其侧链中含有电子给体原子，因此对过渡金属离子如Co2 +，Cu2 +，Fe2 +，Ni2 +和Zn2 + ，具有较高的亲和力。IMAC的配体被设计为利用生物分子尤其是抗体的这种特性，其中配体共价连接的螯合化合物和连接到基质上的间隔基团偶联。螯合化合物根据被占据配位键的数量，从二齿（α-氨基苯丙氨酸四唑），三齿（亚氨基二乙酸，IDA），四齿（次氮基三乙酸，NTA）到五齿（三（羧甲基）乙二胺）复合物。
几个报告表明使用IMAC来纯化来自不同物种和亚类的抗体。可以使用IMAC 实现在单个步骤中达到纯度超过90％的抗体。该效率源自存在于抗体重链的第二和第三恒定结合区的连接处的组氨酸残基簇。这些组氨酸部分赋予抗体对固定的金属离子具有高亲和力。据估计，铜固定化的IDA可以结合多达14-16mg / mL的多克隆或单克隆抗体。IMAC已被用于从不同来源纯化IgG，例如人类、人源化鼠IgG和山羊IgG。
IMAC一直是纯化重组蛋白的首选方法，特别是在变性条件下。例如，在大肠杆菌表达系统中的包涵体，其是细胞核或细胞质中蛋白质的聚集体，并且需要高浓度的离液盐来溶解。可以合成重组抗体以便在蛋白质的氨基末端或羧基末端具有组氨酸标签，以提高对金属离子的摩尔亲和力。在色谱步骤之后，可以通过蛋白酶有效地切割和去除融合标签。这种方法广泛用于Fab片段 和scFv的纯化。根据抗体特性，在纯化之后，可以通过不同方法的组合来实现适当的折叠。郭等使用柱上复性系统通过将单链Fv（scFv）抗体片段与干扰素-γ诱导蛋白10（IP10）融合，从包涵体获得功能蛋白。IP10为诱导活化的T细胞和NK细胞趋化性的趋化因子。
总体而言，由于IMAC基质系统的稳健性、较低的成本、盐洗脱蛋白质的温和条件，IMAC优于Protein A或G方法。然而，对金属离子没有亲和力的蛋白质不适用于IMAC。另外，含有螯合剂如EDTA，铵盐的缓冲液可以从树脂上剥离金属离子，限制了使用IMAC的纯化。
3.2.2.5 硼酸亲和层析（BAC） BAC方法利用硼酸或其衍生物作为配体。硼酸在含有顺式二醇基团的化合物的碱性水溶液中形成稳定的环酯。通过变为酸性pH来实现硼酸酯的分离。BAC利用抗体Fc区中聚糖的存在进行纯化。最近，刘等人制备了限制性进入硼酸盐亲和性多孔整体柱，作为用于特异性捕获抗体的Protein A的模拟物。该仿生方法使用多孔整料的空间位阻并使用硼酸作为特异性配体。BAC由于其低成本、高稳定性和基于pH条件变化的快速洗脱动力学而具有前景。
3.2.3 合成配体 诸如X射线晶体学和核磁共振（NMR）的高分辨率方法进行的高通量引导物的发现和筛选的进展，有助于开发能够克服天然配体相关的化合物的弱点，例如脆性和在生产和程序优化中极高的成本。这些新一代化合物分子量低，不污染环境。这些化合物可以通过使用模板，基于考虑其结构和功能方面的理论设计，或使用组合方法从文库中识别模板;或通过基于模板生成库的两种方法的组合。通过这种方法产生的产物可以进一步修改，以获得所需的特异性和亲和力，从而最小化工艺优化的努力。产生的产品可以根据起始材料分为两大类。肽基和非肽基配体。
3.2.3.1 肽基配体 用于纯化其同源蛋白质的不同组合的小肽形式的氨基酸，被称为肽基配体。杨等筛选了六聚体肽珠库，其由在氨基末端组氨酸和在芳香族氨基酸侧翼的羧基末端带正电荷的氨基酸组成。这种方法鉴定了His-Trp-Arg-Gly-Trp-Val的肽，可以从人、牛、小鼠，山羊和兔子等中纯化IgG亚类。针对来自小鼠腹水的抗粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GMCSF）mAb筛选合成四肽文库 ，导致Ala-Pro-Ala-Arg肽的鉴定。同样，Fassina等 筛选出用于从人血清纯化IgG的合成多聚体肽文库。
除了筛选肽文库外，还合成了一组仿生配体，以提取天然配体的性质。在配体的合理设计中组合方法的例子来自两项不同的研究，其合成了IgG-Fcc受体的配体模拟蛋白质序列涉及蛋白质与IgG-Fc区域的结合，用于纯化小鼠和人IgG。Sugita等使用点合成肽阵列产生八聚肽文库，并通过氨基酸取代测定鉴定了两个肽序列。同样，Gong等从噬菌体展示筛选鉴定与环肽文库微调Fc-III肽，并合成含有两个二硫键的Fc-II-4C肽，与各种物种的IgG表现出更高的稳定性和亲和力。其他几个组已试图鉴定模拟Protein A的小配体。
3.2.3.2 非肽基配体 非肽基配体也称为非肽配体（NPL），最初是在探索靶蛋白上潜在的结合位点后制备的。开发这些配体以克服合成肽配体的弱点，合成肽配体具有易裂变且易于降解的易失性肽键。NPL的基本要素是基于化学，包括拟肽、通过置换氮原子而不是α-碳而合成的蛋白酶抗性肽、或通过在两个碳原子之间引入乙基部分， 因此为多肽分配新的二级结构。相反，非肽类低分子量化合物通过化学合成，具有与IgG的高亲和力和特异性。
这些从头合成和优化的分子具有非常高的亲和力、耐久性和容量，化合物生产成本非常低。NPL的实例包括二氯吡啶（AvidAL）、嗜硫凝胶（二乙烯基砜活化的琼脂糖）及其衍生物与杂芳族配体和组氨酰-琼脂糖基质偶联。基于纺织染料作为仿生配体的性质，通过遵循NPL方法设计了几种其他小配体。其中，基于氯代三嗪的染料使得重新设计合成几种这样的化合物。例如，由人造蛋白A（ApA）和氰尿酰氯合成的配体22/8。这些三嗪类化合物被进一步改性并作为MA吸收剂A1P和A2P可商业化购买。基于其以选择性和可逆方式结合蛋白质的能力的另一组NPL化合物，包括Cibacron Blue FG-3A和单 - 或二氯 - 三嗪（通过偶联偶氮，蒽醌和染色质结合子融合与氯代三嗪环共轭）。这些合成配体的衍生开创了使用组合策略开发用于纯化抗体的低成本和稳定配体的多种可能性。
3.2.4 亲和标签 亲和标签是短多肽序列、蛋白质/蛋白质结构域或酶，作为与靶蛋白的融合伴侣。这些标签对不同的配体具有高度的特异性，因此，由于在仅仅几个步骤中获得了相关的高产率和纯度，它们在重组抗体形式的纯化中有相当的用途。将所需标签的cDNA引入抗体表达基因的N-或C-末端，使得标签肽/蛋白质以与抗体相同的开放阅读框架表达，产生抗体融合的表达标签。特定的配体然后用于纯化融合到标签的这些抗体。可以去除融合的标签以产生纯化的抗体。
表3：不同来源的主要污染物
已经报道了具有各种优点和缺点亲和力标签。一个理想的亲和标签会具有不扰乱抗体结构和功能的优点。此外，如果需要的话，它应该很容易从最终产品中移除。然而，亲和标签可能会改变亲和性与特异性，导致抗体聚集，导致不正确的折叠，易于蛋白酶降解，并且难以切除。聚组氨酸标签是用于抗体纯化最常用的标签。用于抗体纯化的其他标签包括FLAG，c-myc，血凝素（HA）和抗生物素标签。多个标签，即组合标签可以提高蛋白质溶解度和改进纯化。
4. 亲和层析：实际考虑抗体的亲和纯化通常包括4个步骤：i）准备样品加载在亲和柱上；ii）加载并将样品与配体孵育以促进结合；iii）从柱中洗去未结合的组分；iv）从固定化物洗脱（回收）结合的抗体配体以收集纯化的抗体。下面简要讨论这些步骤。
4.1
样品准备 起始材料的制备是亲和纯化的第一步程序。在使用mAbs的情况下，重要的是鉴定其同种型以选择配体进行有效的纯化。基于ELISA和侧向流动的测试都可用这个目的样品表征以验证抗体应在细胞外或细胞内表达，确定要使用的提取和澄清程序的类型。简单的提取方法包括渗透休克，弗氏细胞压碎器或超声处理以促进抗体释放到细胞外。如果抗体表达为聚集体，可以使用变性剂例如尿素和盐酸胍。
抗体来源（腹水，杂交瘤上清液和微生物培养）含有大量其他蛋白质（表3）可能会干扰纯化过程。这些污染物可以通过使用离心的样品，澄清技术或过滤除去沉淀。使用辛酸或硫酸铵盐是澄清原料的另一种有效方法，通过形成沉淀来除去均质物中的一种或多种可溶性组分。沉淀程序可用于减少大部分材料，也可用于沉淀抗体（阳性）或其他蛋白质（阴性）；最终产品是抗体富集物。
4.2
结合 一旦准备好样品，它就被添加到柱子中与配体进行结合。基于抗体对配体的亲和力，特别考虑因素是慢流速和较长的孵化的样品与配体通常在纯化时需要低亲和力抗体。每个配体都有自己的特定最佳结合特性如温度，pH等。有必要仔细考虑这些条件用于缓冲液制备，以促进抗体与配体之间的最大结合。也可以通过改变盐浓度来促进结合，如果涉及疏水或离子相互作用。在蛋白质含有二硫键的情况下，添加还原剂如巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）可能有帮助。
4.3
洗涤 一旦抗体与配体相互作用，则柱子用足够的洗涤缓冲液处理以除去所有的非特异性组分（未结合或弱结合）粘附基质或配体。一般来说，非特异性结合是通过弱离子相互作用或疏水相互作用，与特异性的结合相比具有低的结合强度。非特异性组分的结合可以通过添加盐（NaCl，MgCl 2）来容易地处理，通过改变洗涤剂的pH和/或添加（Tween-20，Triton X-100）。有时候加的阻断剂如牛血清白蛋白或少量的模拟剂是有帮助的。
4.4
洗脱 洗脱可以是特异性的或非特异性的，这取决于所用的方法。特异性洗脱是通过加入模拟剂，其可以与配体或抗体竞争性结合，从而将抗体从配体上置换下来。特异性洗脱是一种温和但缓慢的方法。这类洗脱需要优化竞争剂的浓度以确保抗体完全从配体上洗脱下来。例如，应用咪唑洗脱抗体。
通过改变溶剂条件（pH，离子强度和极性）进行洗脱，被称为非特异性洗脱。非特异性洗脱比特异性洗脱更快，但是，由于粗糙，可能引起配体浸出；限制了柱子的使用时间。低pH下的洗脱是非特异性洗脱中最常用的方法。然而，像其他蛋白质一样，抗体对pH也非常敏感并且使用非常低的pH可导致其聚集。洗脱在低温或使用添加剂如盐（NaCl，MgCl2或LiCl），盐酸胍，尿素或有机溶剂可以考虑增强洗脱。
5. 结论和展望下游处理是抗体生产的最后阶段，这不仅决定了最终产品的质量，也极大地影响商业成本。抗体在进入市场之前有很多步骤必须进行，如纯化，质量评估，病毒检测和疗效测试。抗体纯化作为抗体生产的限制因素，其成本已成为瓶颈 ，导致增加了抗体相关产品的总体成本。
抗体商业市场的增长与基于抗体的治疗应用需求的增加，增加了行业降低成本和时间的压力。近五年来，FDA批准的基于抗体的治疗迅猛增长，使得制备抗体成为生物制药行业最有希望和增长最快的领域 。但无奈地，即使市场的高需求，也没有明显的证据表明下游加工过程在发展。下游处理占制药总成本的50-80％。值得注意的是发展基于抗体的治疗需要纯化抗体许多额外的阶段，而不仅仅是在他们的最后生产阶段 ，预计这会导致这些治疗剂成本的提高。
多年来，基于蛋白A的抗体纯化已经是工业抗体纯化的坚实技术，因为大多数商业抗体是单克隆或多克隆。明确的是，需要从测试和建立色谱上进行大的飞跃，数十年来已经成为抗体纯化方法的支柱。因此，很多近期的研究工作已经针对改善蛋白A的稳定性和结合力容量。然而，重组抗体的进入肯定会削弱它在市场上的统治地位。此外，还加大力度在增加抗体纯化的产量时，提供粗糙，自动化和时间成本效益的额外优点 。但是，这些试验仍处于起步阶段，在广泛应用之前面临很多挑战。
参考文献：
Arora S, Saxena V, Ayyar BV.Affinity chromatography: A versatile technique for antibody purification.Methods. 2017 Mar 1;116:84-94.
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