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等温扩增技术作为一种核酸分子诊断技术，从诞生之日起就不断受到研究者的青睐，但也少不了质疑，甚至摒弃。引起这种截然相反的态度的原因在于等温扩增技术自身所存在的缺陷。而最为突出的一点是，在建立方法或者实际样本检测的过程中，等温扩增技术引起假阳性结果的概率相对较高，使得其实际应用范围变窄，未能真正显示出其检测优势。因此，推出这经验篇来回答“当等温扩增出现假阳性时应该如何应对？”。
01假阳性现象
假阳性是指检测阴性材料得到阳性结果。如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果，提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。
02 造成假阳性的原因
1. 样品间交叉污染：样本污染主要有收集样本的容器被污染，或样本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有样本而造成相互间交叉污染；样本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染；
2. 扩增产物污染：这是反应中最主要最常见的污染问题。因为扩增产物拷贝量大，所以极微量的产物污染，就可形成假阳性。
3. 气溶胶污染：在空气与液体面摩 擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。
4. 实验室中克隆质粒的污染：由于克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题比较常见。
03 假阳性问题的试验控制
在扩增检测时，可设立阴性对照样品和阳性对照样品。阴性对照样品检测为阴性时，表明试验全部过程的试剂没有受到污染；阳性对照样品检测为阳性时，表明DNA提取（RNA提取、RNA反转录）、DNA扩增和电泳鉴定工作体系正常。在阴性对照样品和阳性对照样品检测结果成立的前提下，才能对检测样品进行判定。只有设立试验全程的对照，才能证明试验结果成立。
造成假阴性的原因可以通过设置试验对照来查找。 试验对照包括： 1、DNA阳性对照：以含有目的片段的DNA(或质粒）作为模板进行扩增，证明试剂是否有效、扩增过程是否正确及待测样品中是否含有目的片段。（注意：阳性样品扩增效率高，应严格控制，避免其成为潜在的污染源）。
2、DNA阴性对照：以不含有目的片段的阴性样品作为模板进行扩增，用于证明扩增过程中无假阳性现象。
3、空白对照：以纯水作为模板进行扩增，用于证明扩增过程中无假阳性现象。
4、等温扩增抑制物对照：在与阳性对照相同的反应体系中，加入相同数量的待测样品DNA，如果未扩增出目的片段，证明此待测样品DNA中存在扩增抑制物。
5、空白提取对照：空白提取对照扩增结果为阳性，说明DNA提取试剂可能受到污染。
6、阳性提取对照：阳性提取对照扩增结果为阴性，说明提取过程可能有误。 如果DNA阳性对照扩增结果为阴性，或者DNA阴性对照和空白对照扩增结果为阳性，则说明PCR试剂或扩增过程存在问题。
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假阳性解决途径 由于扩增的敏感性和效率特别高，所以少量的扩增产物污染标本或反应管即可出现假阳性。尤其是扩增产物和质粒分子很容易造成实验室的污染，导致假阳性现象发生。
1、规范实验室设计 实验室设置上分配液区、DNA提取区、扩增区、电泳区。物流应按分配液区、模板提取区、扩增区、电泳区顺序，严禁倒流。在连续而独立的空间中完成不同实验步骤。不同工作区域相互隔离，通过传递仓传递。
2、规范试剂耗材管理 1）验证：新购买的试剂需进行实验前验证；
2）分装：双蒸水、引物和dNTP均应分装储存，并标明日期，以防污染；试剂的分装应在装有紫外灯的超净工作台上进行；试剂分装成小份一次使用后弃去。
3）消毒：除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。必要时，在加样本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。
3、规范实验室操作 1）控制污染源：扩增产物和质粒操作空间是最大的污染源，应严格防止将这个空间的物品带出；
2）一次性用具：使用实验服和一次性手套，使用带有滤膜的移液器枪头，一次性反应管和离心管；
3）定期消毒：定期对实验室进行紫外照射，用10%漂白剂、3％双氧水或专用商业产品清理实验室台面及死角。
4）定期通风：对实验室定期进行正压、负压通风处理；
5）小心操作：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；加样时，最后加阳性对照。
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面对实验的假阳性个人建议 1、端正心态，坚持不懈地探索。
2、引物设计要过关。
3、关注Bst DNA聚合酶的选择和质量。
4、关注dNTPs的质量。dNTPs建议分装保存在-20℃。低质量的dNTPs不仅导致阳性扩增效率下降，还能引起非特异性扩增，即假阳性结果。
5、关注引物的质量。如果是引物质量引起的假阳性。 解决的对策有： （1）提高纯化级别至HPLC，以排除引物干粉掺杂物对体系的影响； （2）选择质量过硬的合成机构； （3）严格遵循引物保存的条件：干粉和高浓度引物液-20℃可保存数月；非干粉和工作浓度引物液4℃保存不超过一周。
6、优化反应体系。对于等温扩增技术而言，优化反应体系是解决假阳性扩增最为直接、有效的方法。当然，在进行体系优化前，要保证所有体系成分都不会引起假阳性。换言之，要确认好是反应体系配方引起的假阳性。
7、样本成分耐受性影响。在建立等温扩增技术时我们往往会忽略实际样本成分给扩增带来的影响。由于实际样本绝非是纯的核酸样本，纵使用最好的纯化试剂盒，部分样本成分仍然会出现在最终提取液中。这些样本成分包括尿素、尿酸、血清、血清、胆汁酸等，在等温扩增时会使阳性反应速率变慢，诱发假阳性扩增或假阴性结果。因此，一个好的检测试剂盒，必须对一定量的样本成分有很好的耐受性。推荐在方法构建好之后，必须进行实际样本检测或者模拟实际样本检测等实验。
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总结 上述建议并非是解决假阳性问题的万能钥匙，可做大家参考。相信其他从事等温扩增研究的人也都有其解决假阳性问题的经验与方法。彼此经验共享对于等温扩增研究领域的健康发展是至关重要的。 ------------------------------------------------------------------------------ End
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发表于 2020-9-17 00:17:32
