小背景
切刻酶辅助扩增反应，可以有以下几种称呼： NEAR，nicking enzyme-assisted reaction； NEAA，nicking enzyme-assisted amplification； NEMA, nicking enzyme-mediated amplification； EXPAR，Exponential amplification reaction。
该技术由Ionian Technologies, Inc.于2000年发明；2010年被Alere收购；2017年被雅培收购。是的，该技术就是雅培推出5min获得新冠检测结果ID NOW的核心技术。
NEAR技术目前已经得到比较广泛的应用 图片来源：C.Qian,et al./Analytica Chimica Acta, 2019
该系统的核心组成：
- 能特意的识别DNA序列5’-GAGTC-3’/5’-GACTC-3’,并且仅仅在距离识别位点3’端4个核苷酸的位置切割含有识别序列的单链DNA。
- 切刻内切酶，最早发现于1988年，后续又有不同的切刻内切酶被发现，以及工程菌被开发。不同的内切酶识别序列和切割位置可能会有不同。如下图，是列举的部分切刻内切酶相关信息。
部分切刻内切酶相关信息 图片来源：C.Qian,et al./Analytica Chimica Acta, 2019
- 该聚合酶可以以DNA双链的一条链为模板进行新链的合成，新合成的链替换旧双链中的序列相同的旧链，即链置换。
- 可以选择不同的具有相同功能的链置换DNA聚合酶，如Bst、Klenow、Vent等DNA聚合酶。
从5‘-3’含有稳定序列、切刻内切酶识别序列、配对序列； 操作原理：
1、引物（正向引物）结合目标模板（template 1）延长，形成双链DNA； 2、切刻内切酶识别结合位点，剪切带有识别序列单链DNA； 3、剪切后产生缺口，带有游离3‘端，链置换DNA聚合酶重新从缺口处继续合成新链，并置换出上一轮合成的DNA链； 4、被置换出来的DNA链可以作为模板（template 2）继续被引物（反向引物）识别，同样的形成双链DNA； 5、重复步骤3和4； 6、此步被置换出来的DNA即新合成的template 1。
NEAR技术原理模式图
注意事宜：
1、目标序列的长度一般建议在200bp左右，此方法不适用于长链合成； 2、建议正反向引物比例约3：1； 3、为了促进反应更快进行，可以在系统中少量添加不含有切刻内切酶识别序列的正常引物，主要是辅助快速扩增模板。 4、建议反应温度54-58℃，反应时间15-30min。
基于核心原理，可以有不同的展现形式，万变不离其宗！
1分钟……叮咚！
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发表于 2020-10-16 21:50:20
