人工抗原合成研究进展

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近年来，以小分子化合物为半抗原的免疫分析技术在食品药品、环境保护等领域已有诸多应用，并取得了较为理想的检测效果。小分子化合物只能与载体偶联形成人工抗原后，方能借助T细胞表位间接诱导B细胞进行增殖与分化，进而产生特异性抗体。高效的人工抗原的合成是保证免疫分析的前提和关键，就近年来国内外有关人工抗原合成过程中所涉及的小分子半抗原的设计与合成方法、载体的选择、半抗原与栽体的偶联方法、人工抗原的纯化及鉴定方法等进行综述。

免疫分析技术(LA)是以抗原和抗体之间的特异性识别、可逆性结合为原理的分析技术。因其具有特异性强、灵敏度高、操作相对简单、检测速度快、成本低廉等诸多优点而备受瞩目。此项技术不仅在细菌、核酸、蛋白质等大分子化合物的检测方面应用广泛，在检测相对分子质量小于1 000的小分子化合物方面也发挥着极为重要的作用。近年来，在食品安全、抗生素残留、环境污染、毒品检测、医药研发等诸多领域，以检测小分子化合物为目的的免疫分析技术层出不穷。

与蛋白质、核酸等大分子化合物不同，小分子化合物具有反应原性而无免疫原性，即缺乏T细胞表位而无法直接诱导机体产生相应的特异性抗体。因此，小分子化合物只能被称为半抗原(不完全抗原)，需根据免疫学原理将其与载体大分子偶联后形成人工抗原，从而获得免疫原性，人工抗原再借助T细胞表位间接诱导B细胞进行增殖与分化，进而产生特异性抗体。

高效的人工抗原的合成是保证免疫分析的前提和关键。如何针对待检测物质设计小分子半抗原、如何选择载体、如何将小分子半抗原与载体偶联，以及如何进行人工抗原的分离纯化等诸多因素影响着人工抗原的产量及质量，进而影响到抗体对待测小分子物质的特异性免疫能力。基于此，本文就近年来国内外人工抗原合成过程中所涉及的半抗原的设计与合成、载体的选择、半抗原与载体的偶联、人工抗原的纯化等进行了综述，以期为相关研究提供理论及实验参考。

1半抗原的设计与合成

1.1半抗原的设计原则

许多待检测的小分子由于稳定性等问题，无法直接作为半抗原，因此，需利用其结构类似物作为半抗原。这就要求，半抗原的设计应尽可能与原待测小分子相似(分子结构、特征基团、立体化学、电子分布、电子云密度和疏水性)，从而保证获得的抗体能够与原待测小分子发生特异性免疫反应。例如，天然的磷酸化组氨酸存在着两种形式，即π-磷酸化组氨酸(π-pHis)和T-磷酸化组氨酸(T-pHis)，两种分子中的磷酸基团均连接在组氨酸咪唑环的氮原子上，形成的N-P健在酸性条件下极不稳定(图1)。因此，无法直接以其作为半抗原制备组氨酸磷酸化蛋白的特异性抗体，只能寻找与它们结构相似的小分子。Kee等引以三唑环和吡唑环替代T-pHis中的咪唑环，以性质稳定的c-P键替代磷酸化组氨酸中的N-P键，得到了两类磷酸化组氨酸结构类似物pTze和pPye，以其作为半抗原制备的抗体对组氨酸磷酸化蛋白均表现出良好的识别能力。因pPye的环结构更接近-pHis，它的抗体较pTze抗体识别能力更为优异。

由于抗原的免疫原性与半抗原分子空间结构的复杂程度呈正相关，引入不饱和的立体结构(苯环、杂环和支链等基团)，增加半抗原结构的复杂性，突出抗原决定簇，能显著增强抗原的免疫原性，产生高效价的抗体，但其特异性将会受到影响。Kim等在研究半抗原异质体对有机磷杀虫剂倍硫磷的免疫分析灵敏度和酶联免疫吸附实验时发现，半抗原分子支链上含有5个亚甲基时产生的抗体比三个亚甲基产生的灵敏度高3.5倍(表1)。Goodrow等。认为，如半抗原分子具有苯环结构，则制备抗体的成功率可达到30％，而不含苯环结构制备抗体的成功率仅为9％。

1.2半抗原连接臂的选择

半抗原的特征结构和载体蛋白之间的连接需要一定的媒介，即连接臂。连接臂多为碳链，以确保半抗原小分子能充分暴露在人工抗原的表面，最大限度地被免疫机体识别。如果半抗原小分子结构中具有活性基团，如氨基、巯基、羧基、羟基等，其可直接与载体蛋白偶联；若没有上述活性基团，则需要根据免疫学理论并结合原待测小分子自身结构特点进行设计，即在连接臂末端引入相应的活性基团，但要确保连接臂不诱导机体产生“臂抗体”。

半抗原连接臂的选择一般应遵循以下原则：

(1)连接臂与半抗原小分子连接的位置应尽量远离半抗原小分子的特征官能团，最大限度的使特征部位裸露在外，以避免对特异性抗原决定簇的干扰，提高抗体的亲和性和特异性，提高抗体与目标半抗原的识别能力。研究表明，当半抗原在不同的连接位点与连接臂连接，修饰后形成的半抗原的空间结构和电子分布等均不同，导致最终产生的抗体的特异性、亲和力和效价值不同。原因主要有以下两个方面：一方面，连接位点与半抗原的特征结构距离过近，则结果与连接臂过短产生的影响相同，即半抗原分子的特征结构不能充分暴露在人工抗原的表面，从而影响机体的免疫系统对半抗原的识别；另一方面，连接位点不同，连接臂的电子分布对半抗原的电子分布产生不同影响，半抗原的电化学性质发生变化，从而影响机体免疫系统对半抗原的识别，导致抗体的特性发生变化。因此，在选择连接位点时，即要充分考虑半抗原分子特征结构的裸露，也要注意连接臂的电子分布对半抗原的影响。

贾敏在设计雌酚类半抗原时即充分考虑了连接臂的引入位点：雌酚类半抗原有三种结构，分别是己烯雌酚(DES)、己烷雌酚(HEx)和双烯雌酚(DIs)(图2)。引入连接臂时，可从烃基部位引入或从酚羟基部位引入。但如在烃基部位引入连接臂，对于DEs、DIs而言，其特异性的双键结构被破坏，导致制备的抗体特异性弱；对于HEx而言，其烃基部位不易活化，连接臂引人较为困难。如从酚羟基部位引入连接臂，对于DEs、HEx和DIs而言均易制备，且保留半抗原的特异性结构，因此制备的抗体具有较强的特异性。

(2)连接臂长度应适宜，目前部分学者认为连接臂的最佳长度为3～6个原子。连接臂过短，则载体的空间位阻会对半抗原特征结构产生影响，使半抗原分子的特征结构不能充分暴露在人工抗原的表面，从而影响机体免疫系统对半抗原的识别。连接臂过长，则连接臂会受到自身或者外界影响发生“折叠”，半抗原不能充分展开，导致半抗原分子的特征结构部分被载体蛋白掩盖，半抗原不被机体的免疫系统识别。李静宇等对呋喃唑酮代谢物人工抗原的合成进行研究时发现，引入6个原子碳链的连接臂比引入1个原子碳链的连接臂效果更好，免疫机体对抗原识别能力高、特异性强。施海燕和王鸣华副研究2-甲基-4-氯苯氧基乙酸(M)和二氯喹啉酸(Q)人工抗原合成时，分别以含有0、4、6个碳原子连接臂的半抗原与BSA偶联，也得到了相同的结论。此外她们还发现，半抗原主体结构相同时，连接臂的增长会显著增加半抗原与载体蛋白的的偶联率；连接臂长度相同时半抗原主体结构也会影响偶联率(图3)。

Kim等在研究连接臂长度对抗体的影响时发现，当其他条件一致时，连接臂的长度在2～6，不同免疫原产生的抗体在亲和能力、特异性、灵敏度方面都没有明显的差异。赖丹等在研究邻苯二甲酸酯塑化剂人工抗原的合成时，用零连接臂的半抗原与BSA偶联也得到了特异性较好的抗体。

(3)连接臂的引入通常以末端含活性基团(如氨基、巯基、羧基、羟基、硝基、羰基等)的链烃为最佳，尽量避免引入含共轭双键或杂环的连接臂，最大限度减少抗体对连接臂的识别，提高对半抗原的识别。王倩等在研究去甲替林人工抗原的制备时，其半抗原连接臂中含有烃基支链、叔氨基和羰基(图3a)。Li等在研究3-氨基-2-嗯唑烷酮半抗原的合成时，在半抗原连接臂中引入苯环和酚羟基，结果显示制备抗体的特异性显著增加(图3b)。

(4)连接臂的引入应确保其与母体成键的稳定性，即制备过程中不易断裂，免疫过程中在动物体内稳定。此外，还应考虑反应条件应较为温和，产物易分离纯化，产率高，并考虑成本因素，以便量产。

以上原则和实例表明，对连接臂长度的确定目前依然没有定论，对于不同的母体结构，确定最适连接臂长度和末端活性基团，往往需要进行正交试验才能得到准确的结论。

1.3半抗原的制备、纯化与鉴定

半抗原制备是指通过化学方法对无连接臂或者需要基团保护的半抗原小分子进行适当修饰。目前报道的半抗原制备主要是在半抗原小分子的连接位点进行基团转化，进而引入连接臂。常用的化学修饰法有：(1)氧化法，如羟基氧化成醛基；(2)还原法，如硝基还原成氨基；(3)水解法，如叔氨基水解成氨基、酯基水解成羧基等；(4)加成法，如双键加成；(5)取代法，如卤素原子被取代等，如表2所示。

zhang等研究四溴双酚A类化合物半抗原的合成时同时采用了取代法、加成法和水解法，具体合成路线如图5所示。

目前报道较多的对半抗原进行分离纯化的方法包括TLc法、柱层析法、萃取法等。TLc法虽能得到较纯的产物，但其制备量少所以应用较少。柱层析法和萃取法因操作简单、耗材少且溶剂可回收利用而应用较为广泛。

常用的半抗原鉴定方法有红外光谱法，紫外光谱法、ESI-MS法、核磁共振法、元素分析法、HPLC-MS法等，质谱法与核磁共振法结合运用可快速鉴定半抗原的结构和分子质量。

2半抗原与载体的偶联

2.1载体的作用

在人工抗原合成的过程中，载体起着至关重要的作用。由于半抗原自身分子质量小，无法诱导免疫应答，因此需要依靠载体的特异性和免疫原性，诱导机体产生免疫应答反应，从而诱导对半抗原的识别。选择载体时应对以下几个因素进行综合考虑：(1)载体要有充足的活性基团与半抗原偶联；(2)载体要有弱免疫原性；(3)载体要有良好的溶解性；(4)载体对机体无毒；(5)载体相对廉价易得。

2 2载体的种类

目前常用的载体主要有三大类：蛋白质、多聚肽和大分子化合物。蛋白质类载体中最为常用的是牛血清蛋白(BSA)、鸡卵清蛋白(0VA)、和钥孔血蓝蛋白(KLH)。其中，BSA运用得最多，连接技术也最成熟，这是因为它不仅理化性质稳定、不易变性、免疫活性好、价廉易得，而且自由氨基多，在不同的pH、离子强度及有机溶剂下均有良好的溶解度。KLH虽免疫活性最好，但是其价格昂贵，所以运用得较少。近年来，也相继出现了与牛γ球蛋白(BGG)、兔血清蛋白(RSA)、甲状腺球蛋白(thyrodobulin)、猪血清白蛋白(PSA)和鲎血蓝蛋白(LPH)等进行连接的新尝试。除蛋白质类载体外，研究者也尝试利用人工合成的多聚肽，如多聚赖氨酸(PLL)代替载体蛋白与小分子半抗原连接。与蛋白质类载体相比，多聚肽中游离的氨基密度更大，偶联条件温和，偶联率高，且多聚肽自身的免疫原性低，最终获得的抗体中抗载体的部分较少，抗半抗原的部分较多，对半抗原的识别能力高。此外，也有人报道用大分子聚合物代替载体蛋白，如羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮。但目前大多数研究工作仍然使用蛋白质作为载体，多聚肽和大分子聚合物应用较少。

2.3半抗原与载体的偶联原理及方法

合成人工抗原的基本原则主要包括，偶联后的产物偶联率均一、稳定；易于纯化分离；偶联条件温和；最重要的是产物的结构要尽量减小对抗原特征基团的影响。目前报道半抗原与载体的偶联方法有化学偶联法、化学生物学法和免疫学标记法。其中化学偶联法最为常用，其具体的方法及原理见表3。

目前绝大多数人工抗原的制备均是一种载体蛋白偶联一种半抗原，其制备出的抗体特异性高，但对于同母体衍生物的检测，如抗生素来说则是一种局限。sai等在研究牛奶中青霉素类和四环素类药物含量检测时，依次将阿莫西林和金霉素与BSA偶联制备新的双半抗原免疫原。获得的抗体同时与六种青霉素类药物(阿莫西林、青霉素G、氨苄青霉素、青霉素V、羧苄青霉素和磺苄青霉素)和四种四环素类药物(四环素、土霉素、强力霉素和金霉素)交叉反应，交叉反应性范围在24％～100％。酶联免疫吸附试验显示，抗体可同时检测牛奶中的10种药物且检测限在0.4～0.3ng/ml范围内。这项研究为小分子的免疫分析开辟了新的思路。

3.人工抗原的纯化及鉴定

人工抗原被成功合成后需对其进行纯化，以提高机体免疫系统的识别能力，产生特异性抗体，同时减少杂质抗体。现已报道的纯化方法有透析法、离心法、凝胶层析法、离子交换层析法、柱层析法、盐析法等。目前常用的纯化方法是透析法和凝胶层析法。透析法纯化时问较长，但纯化效果好，且操作简单。凝胶层析法纯化时间较短，但操作复杂，并且需要对组分进行跟踪分析，以确定目标产物。为确定半抗原与载体是否成功偶联，需要对偶联后的产物进行鉴定。目前报道的鉴定方法有核磁共振法、红外光谱法、紫外光谱法、荧光光谱法、圆二色光谱法、凝胶．高效液相色谱法、原子力显微观察法、元素示踪法、元素分析法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、ESI-MS分析法、MALDI-TOF-MS分析法、考马斯亮蓝法等。其中核磁共振法、紫外光谱法和红外光谱法最为常用。

具有良好免疫原性的人工抗原是免疫分析成败的关键。对于人工抗原的设计合成、分离鉴定的方法，目前国内外已有很多例子供我们借鉴。但由于小分子化合物结构的多样性及免疫应答的复杂性，对于一个具体的待测小分子化合物，其连接臂的连接位点、连接臂的长度、载体的种类、与载体的连接方法及偶联比等因素，均需设计、组合出多套方案，并通过免疫活性测试，优化筛选出最佳条件。这个过程往往花费大量的人力、物力且实验结果存在一定的偶然性。因此，利用计算机辅助、分子模拟及网络数据库分析等技术手段，对半抗原分子结构进行设计、模拟，并预测半抗原分子结构与潜在免疫特性的关系，实现半抗原分子设计与抗原合成的预见性，成为该领域未来的重要发展方向。