设计一种基于多表位肽的SARS-CoV-2疫苗

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摘要

在本研究中，我们在SARS-CoV-2的整个结构蛋白上定位了几个免疫原性表位（B细胞，T细胞和IFN-γ），并通过应用各种计算和免疫信息学方法，我们设计了一种基于多表位肽的疫苗，可引起世界上最大比例的人群中高免疫原性应答。为了确保重组疫苗在大肠杆菌中的高表达，我们还进行了密码子优化和电子克隆。发现了对TLR3和TLR4具有高分子亲和力的设计疫苗能够启动有效的先天和适应性免疫应答。免疫模拟还表明，B细胞和T细胞介导的免疫水平会升高，并在随后的抗原接触后清除系统中的抗原。满足预期结果说明拟议的疫苗很有希望，因此，应通过实际实验对其中和SARS-CoV-2的功能和功效进行测试。





引言2019年冠状病毒疾病（COVID-19）是人类呼吸道感染为特征的最严重的传染病之一。根据世界卫生组织（WHO）2020年4月10日的最新报告，来自212个国家，或地区，累计COVID-19确诊病例超过14,395,16例，累计死亡 85,711例。2019年12月初，COVID-19在中国湖北省武汉市爆发，但中国疾病预防控制中心于2019年12月31日发布了症状病因不明的重症肺炎患者的报告。随后，卫生专业人员确认了新型的β冠状病毒（SARS-CoV-2）是引起该肺炎病例簇的病原体。关于感染源的调查表明，SARS-CoV-2病毒与中国武汉市的海鲜市场有关，该市场接触史的感染病例在很短的时间内就在中国大量传播。当科学家/卫生专业人员认真地了解了COVID-19的传播模式时，它已经到达并感染了不同国家的几个人，并以看不见的不断增加的传播率进行传播。这导致世界卫生组织于2020年1月30日宣布COVID-19为国际关注的突发公共卫生事件（PHEIC）。

直到2002年和2003年爆发严重急性呼吸系统综合症（SARS）为止，冠状病毒被认为是引起动物和人类呼吸道和肠道感染的轻度病原性病毒。随着十年之久的SARS大流行，另一种高致病性冠状病毒，即中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)主要出现在中东国家。对这两种冠状病毒的广泛研究导致人们了解它们在遗传上是多样的，但很可能起源于蝙蝠。除了这两种病毒外，在人类中也常检测到另外四种冠状病毒，即HKU1、229E，OC43和NL63。在迄今为止报道的所有冠状病毒中，SARS-CoV，MERS-CoV和SARS-CoV-2具有较高的致病性和死亡率。在32个国家的广大人口中，仅SARS冠状病毒就造成了8422例阳性病例和919例潜在死亡病例。2012年报告了第一例死亡病例，发现有2496例MERS-CoV阳性，来自27个国家的868例死亡被报道。直到2019年12月SARS-CoV-2爆发，在过去的二十年中，这两种大流行病原体都是高致病性的。SARS-CoV-2已经在212个国家蔓延，仅在过去三个半月中就造成85,522人死亡。与目前的情况一样，一些国家面临着SARS-CoV-2社区传播最致命的问题，例如中国，意大利，西班牙，法国，伊朗，美国，印度，德国等。尽管如此，SARS-CoV-2造成的估计死亡率在中国约为3.6％，而在中国以外约为1.5％，但问题是严峻的，需要紧急应对以遏制迅速的生命损失。

冠状病毒大致分为四个属，即α-CoV，β-CoV，γ-CoV和δ-CoV，其中仅报道了α-CoV和β-CoV感染哺乳动物，但γ-CoV和δ-CoV也被感染能够同时感染哺乳动物和鸟类。对其生物学的广泛研究表明，它们是具有26-32 kb大小范围的正向单链RNA的非分段包膜病毒。 最近的一些研究表明，SARS-CoV-2具有与β-CoV相同的基因组特征，因此SARS-CoV-2的基因组结构遵循5'-leader-UTR-replicase-S（刺突）–E（包膜）-M（膜）-N（核衣壳）-3'UTRpoly（A）尾巴，其病毒基因组3'末端带有随后的物种特异性辅助基因[19]。结构蛋白包括刺突蛋白/表面蛋白（S），包膜蛋白（E），膜蛋白（M）和核壳蛋白（N）。这些刺突蛋白/表面蛋白被认为在病毒存活和病毒发病机理中起着至关重要的作用，由受体结合能力和进入宿主细胞是受表面蛋白的影响而调节的。包膜蛋白和膜蛋白负责病毒的组装，而核衣壳蛋白是RNA基因组合成所必需的。SARS-CoV-2的这种复杂的基因组成和中等的突变率通过靶向所有结构蛋白来战略开发疫苗。不幸的是，迄今为止，尚无针对SARS-CoV-2的批准疫苗。然而，一些研究已经预测了特定糖蛋白的基于肽的疫苗靶标，但是没有研究涵盖疫苗设计的所有结构蛋白。随着集成生物信息学和免疫信息学方法的最新发展，疫苗设计及其特定应用已变得快速且经济的发展，正如通过计算模拟和预测一样，目标免疫原性肽可以被设计和验证其对人体的功效，甚至在之前备有用于实际接触和实验的疫苗。然而，常规方法同时被证明在疫苗设计中是有效的，但有一些局限性，例如：牺牲整个生物体或大的蛋白质残基，不必要地增加了抗原负荷和致敏性。我们认为理想的多表位疫苗候选物可以提高宿主的免疫原性，从而增强免疫反应，从而降低再次感染的风险。从这个角度出发，在这里我们采用疫苗设计的几种综合方法，通过将人类的B细胞，T细胞和IFN-γ表位（体液和适应性免疫应答）定位在相应的结构蛋白上。

方法检索SARS-CoV-2蛋白序列并进行抗原性预测

检索NCBI (GenBank: MN908947.3)上的所有SARS-CoV-2蛋白序列，并提取结构蛋白序列进行进一步分析。我们使用在线服务器VaxiJen v2.0预测了每种蛋白质的抗原性，并对抗原性≥0.4的病毒类蛋白质进行了进一步分析。

预测目标蛋白的理化和二级结构特性

使用Expasy Protpram在线服务器检测目标蛋白的理化性质。使用默认参数的在线二级结构分析工具（SOPMA）来预测蛋白二级结构中的α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲。

3D同源建模和验证

使用三种同源建模工具对目标蛋白的三维结构进行结构模拟。I Tasser、Raptor-X和Phyre2以及使用Galaxy refine服务器对模型结构进行后处理减少建模结构中的任何失真。使用RAMPAGE服务器对建模结构进行Ramachandran作图分析，以进行质量检查和验证，并使用Chimera 1.10.1可视化系统进行可视化。

T细胞表位预测
细胞毒性T细胞（CTL）表位

HLA - i类超型识别的9个氨基酸残基的CTL表位，并残基考虑到 C末端裂解的权重，并对TAP传输效率和表位识别阈值进行加权，最终通过NetCTL.1.2 服务器对A1、A2、A3、A24、A26、B7、B8、B27、B39、B44、B58、B62进行预测。此外，通过免疫表位数据库（IEDB）工具[34]对A*02:02、B*07:02、C*04:01、E*01:01等一系列HLA I类等位基因识别的CTL表位进行了一致性鉴定。鉴定的表位根据一致性评分(≤2分)被仔细检查，只有那些表位被认为是强结合物并被选择进行进一步分析，这些分析是由两种方法的多个等位基因预测的。

辅助T细胞（HTL）表位

使用Net MHC II pan 3.2服务器预测了HLA II类DRB1等位基因识别的15个残基长的HTL表位。将强结合能力和弱结合能力的阈值设置为默认值。使用在IEDB服务器中实施的一致性方法，进一步鉴定了HLA DR等位基因识别的15个残基长度的另一组HTL表位。两种方法中均有一个以上的等位基因预测的≤2%的表位被认为是一个强有力的结合位点，并被进一步分析。

重叠T细胞表位的鉴定

考虑到对多个HLA等位基因具有亲和力的表位倾向于在宿主细胞中诱导相对更多的免疫反应，因此我们使用VaxiJen v2.0服务器与AllerTop v.2.0工具(免疫原性阈值为0.4)对HLA I类和II类等位基因均具有亲和力的重叠表位进行免疫原性和过敏原预测。这些表位可能同时激活CTL和HTL细胞。

连续和不连续B细胞表位的鉴定

B细胞表位是B淋巴细胞表面结合受体识别的短氨基酸序列。它们的鉴定在疫苗设计中起主要作用，因此在相应的结构蛋白序列上预测了两种类型-连续和不连续B细胞表位。使用BCpred 2.0服务器可预测存在于蛋白质表面的连续B细胞表位，而使用Ellipro服务器可预测相当大的不连续表位。诸如最小得分和最大距离（Anstrom）之类的预测参数分别设置为0.8和6。

IFN-γ表位的鉴定

由于IFN-γ是先天和适应性免疫系统的标志性细胞因子，而具有诱导IFN-γ潜力的表位可以增强任何疫苗的免疫原性。因此，IFN表位服务器可以预测每种结构蛋白的IFN-γ表位。

预测表位的表征
保守性分析

将预测的T细胞和B细胞表位提交给IEDB保守性分析工具，以确定结构蛋白序列中的保守程度，并选择具有100％保守性的表位进行进一步分析。

群体覆盖率和自身免疫鉴定

使用IEDB群体覆盖率分析工具预测了人群对所选的重叠CTL和HTL表位对各自HLA基因型频率的免疫原性反应。对那些表现出50％或更多的人口覆盖率的表位进行详细的分析，为了降低自身免疫的可能性，对所有选定的表位进行针对人蛋白质组的BlastP搜索分析。显示与任何人类蛋白质相似的表位不包括在进一步分析中。

表位与其HLA等位基因的相互作用分析

将审校的表位序列提交至在线服务器PEPFOLD 3进行3D结构建模。从具有PDB ID的蛋白质数据库（PDB）中检索出人类中最常见的HLA等位基因的结构，即HLA-DRB1 * 01：01（HLA II类）2g9h和HLA-A * 02:01（HLA I类）1QEW。去除了与HLA等位基因结构相关的任何配体，并进行了能量最小化。
然后使用网络服务器Patchdock将建模的表位与相应的HLA等位基因对接，以研究受体与配体的相互作用模式。将诸如RMSD值和复杂类型之类的参数保持为0.4，并设为默认值。将Patchdock获得的结果提交到Firedock服务器，以提炼出最佳的10个模型。基于整体能量值，对具有整体最低能量的复合物进行筛选，并选择相应的CTL和HTL表位进行最终疫苗构建。

最终多表位疫苗的构建及质量控制

为了构建针对SARS-CoV-2的多表位疫苗，我们在Chauhan等人的方法上进行一些修改。选择的抗原表位需满足以下几点要求：1）。表位必须具有免疫原性，非过敏性，并且必须同时与HLA I类和II类等位基因具有亲和力；2）。表位必须能够同时激活CTL和HTL细胞，并且必须至少达到50％的种群覆盖率；3）。表位不应与任何人类基因重叠，并且预测的B细胞表位应与最终的CTL和HTL表位重叠，且应存在于目标蛋白的表面。基于这些标准，HTL，CTL和IFN-γ表位被包括在多表位疫苗的最终构建中。HTL和IFN-γ表位通过GPGPG linkers连接，而CTL表位通过AAY linkers连接。将NCBI注册号为P9WHE3的50S核糖体蛋白L7/L12（Locus RL7_MYCTU）佐剂添加到N末端，以增强所构建疫苗的免疫原性。

疫苗的抗原性，致敏性和理化特性

使用VaxiJen v2.0服务器预测疫苗的抗原性，并使用Allertop v.2.0预测工具预测疫苗的致敏性。通过将疫苗的最终序列提交给Expasy Protpram在线服务器，预测所设计疫苗的理化特性。

二级结构的预测

使用SOPMA工具对构建疫苗的二级结构进行预测。在输入疫苗序列和输出宽度70的情况下，将构象状态数，相似性阈值和窗宽之类的参数设置为4（α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲），8和17。

疫苗构建体的建模，优化和验证

构建疫苗的最终模型是使用同源建模工具SPARKS-X制备的。在排名前10位的预测模型中，选择Z分数最高的模型，然后使用Galaxy优化服务器进行优化。在所有优化工具中，根据CASP10评估，Galaxy fine是最高效的服务器中的一个。然后，我们使用ProSA-webtool 来评估基于Z分数的预测模型的整体和局部的质量。如果Z分数不处于相似大小的天然蛋白质范围之内，则预测结构的错出错率会增加。为了进一步检查疫苗优化结构的整体质量，使用RAMPAGE服务器进行了Ramachandran做图分析。使用Chimera 1.10.1可视化系统可视化疫苗构建的最终模型。

连续和不连续表位的预测

分别使用BCpred 2.0和IEDB服务器预测了疫苗构建中的连续和不连续B细胞表位。并为了有效设计疫苗，构建的疫苗应具有潜在增强免疫原性反应B细胞表位。

构建疫苗与TLR3和TLR4受体进行分子对接

从蛋白质数据库中可检索到人来源的TLR3和TLR4的3D结构（PDB ID：2A0Z和2z63）。先移出与检索结构上的相连的任何配体，然后使用Galaxy优化服务器对受体进行模型优化。使用Cluspro v.2蛋白质-蛋白质对接服务器进行分子对接分析，以分析疫苗与TLR3和TLR4的相互作用模式。该服务器通过对数十亿个构象进行抽样，将成对RMSD能量最小化，从而提供基于刚性对接的簇得分。基于能量最低原则，选择最终的疫苗-TLR3复合物和TLR4复合物模型，并使用Chimera 1.10.1可视化系统进行可视化。

电子克隆与疫苗优化

多表位疫苗构建体在克隆和表达效率对于疫苗设计至关重要。最终的多表位疫苗构建体被提交到Java密码子适应工具（JCat）中，并在大肠杆菌K12株中进行了密码子优化。除此之外，还选择了避免rho独立的转录终止子、避免原核核糖体结合位点、避免限制性内切酶裂解位点等参数后进行最终提交。JCat工具可提供优化序列的CAI值和GC含量。理想情况下，CAI值应大于0.8或接近于1，GC含量应在30％至70％之间，以确保疫苗具有潜在的翻译能力，稳定性和转录效率。此外，使用SnapGene 4.2工具将多表位疫苗构建体克隆至大肠杆菌pET–28（+）载体上。

疫苗构建体的免疫模拟

为了表征多表位疫苗的真实免疫原性特征和免疫反应，我们使用了C-ImmSim服务器进行模拟实验。位置特异性评分矩阵(PSSM)和机器学习是C-ImmSim预测免疫表位和免疫相互作用的两种方法。它同时模拟了哺乳动物的三个不同的结构区域，即骨髓，胸腺和第三淋巴器官。为了进行免疫模拟，每隔四周注射三次，每次注射1000个疫苗分子。诸如“随机接种”，“模拟量”和“模拟步骤”之类的参数保持为12345、10µl和1050。多项研究表明，两次接种之间的最小间隔应保持4周，因此，三次注射的时间设定为1，84和168，其中每个时长等于真实生活中的8小时。由于有几位患者在全球范围内反复感染SARS-CoV-2，因此，连续注射12次，间隔四周，以评估接种疫苗对SARS-CoV-2的影响。

结果靶蛋白及其抗原性

我们从SARS-CoV-2全基因组29903 bp ss-RNA（GenBank：MN908947.3）中筛选目的结构蛋白序列，即表面蛋白，膜蛋白，包膜蛋白和核衣壳蛋白。从结构蛋白序列进行的抗原性预测表明，包膜蛋白的抗原性得分最高，为0.6025，其次是膜蛋白，核衣壳蛋白和表面蛋白（表1）。

理化与二级结构特性

等电点（PI）的理论估计表明，除了核衣壳蛋白的不稳定性指数为55.09外，所有结构蛋白本质上都是碱性的，其预测的不稳定性指数均低于40，表明其结构是稳定的（表S1）。所有结构蛋白预测的二级结构特征均为不同占比的α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲（表S2）。

靶蛋白的3D结构

从Raptor-X获得的优化的最终3D结构要优于从I Tasser和Phyre2生成的模型，因为Raptor-X模型的异常值百分比最小，因此被选择用于进一步分析（图1）。表S3给出了通过Ramachandran作图分析得到的各种结构蛋白模型的详细信息。

CTL和HTL表位的预测

共预测到包膜蛋白中29个CTL表位，核衣壳蛋白中77个，表面蛋白中340个，膜蛋白中89个表位，这些表位对多个等位基因具有很强的结合亲和力。类似地，预测到包膜蛋白中的35个HTL表位，核衣壳蛋白中的51个HTL表位，表面蛋白中的252个和膜蛋白中的23个表位。所有这些表位都具有强结合能力，预测的百分等级≤2。

重叠T细胞表位的鉴定

核查与HTL表位重叠的CTL表位，并对免疫原性和致敏原性进行预测。共预测到16个CTL在包膜蛋白上重叠表位，8个在核衣壳蛋白上重叠表位，25个在表面蛋白上重叠表位，9个在膜蛋白上重叠表位(表S4-S11)。所有这些被选择的表位都被预测为非过敏且抗原评分高。

B细胞表位的鉴定

在最终确定的CTL和HTL表位中，根据其抗原性、非过敏性和重叠性，选择存在于各自蛋白表面的连续B细胞表位。按照这些标准，在表面蛋白中得到五个表位，在核衣壳中得到3个表位，在膜蛋白中得到1个表位(表S12)。在包膜蛋白中未发现具有此类标准的表位。此外，在包膜蛋白中预测到一个不连续的表位，核衣壳中7个，病毒表面有9个，在膜蛋白上预测到4个不连续的表位(表S13)。

IFN-γ表位的鉴定

服务器IFN表位预测包膜蛋白中有8个表位，膜上有39个，核衣壳上有66个，表面蛋白中存在281个。基于抗原性和非过敏原性，仔细核查了包膜蛋白中的8个表位，膜蛋白中的13个，核衣壳中的43个和表面蛋白中的81个IFN-γ表位。为了获得最高的免疫原性并减少疫苗构建物中表位的过载，我们从每种蛋白质中选择了具有最高抗原性评分和非变应原性的一个表位（表S14）。

预测表位的表征
保守性分析，人口覆盖率和自身免疫性鉴定

保守性预测结果表明，所有选择的T细胞和B细胞表位在目标结构蛋白中都是100％保守的，种群覆盖率预测显示包膜蛋白中的五个表位，膜中的两个表位，核衣壳中的两个表位和表面蛋白中的六个表位被更多地覆盖，覆盖率超过全球人口的50％。未选择的具有大于50％人口覆盖率的表位与任何人类蛋白质具有同源性。因此，总共处理了满足上述标准的30个表位（CTL和HTL表位各5个），用于与人群中常见的HLA等位基因进行相互作用分析（表S15）。

表位及其HLA等位基因的相互作用分析

对每个选择的CTL和HTL表位与各自的HLA等位基因进行分子相互作用分析，从而得到了10个预测的对接复合物。每个复合物显示不同的整体能量值。在表征的30个表位中，整体能量负值最高（设置阈值-40）的表位被视为与相应的HLA等位基因有效相互作用的表位，因此被选作最终的疫苗构建体（表2）。

这在包膜蛋白上产生了两个CTL和HTL表位，膜上一个，核衣壳中两个，还有两个表位在Surface蛋白上。对于一种理想的疫苗，所包含的表位应该对其各自的等位基因具有潜在的亲和力，因此表位与其等位基因之间的相互作用越强，亲和力越高。

构建最终的多表位疫苗

我们选择了七个CTL，七个HTL和四个IFN-γ表位来构建多表位疫苗（图S1）。佐剂通过EAAAK接头与CTL表位偶联，随后，使用AAY接头偶联CTL表位，且使用GPGPG接头偶联HTL和IFN-γ表位（图2）。最终构建的多表位疫苗由430个氨基酸残基组成，然后对其抗原，过敏原和理化特性进行了验证。

疫苗构建体的抗原性，致敏性，理化性质和二级结构评估

该多表位疫苗构建体是具有免疫原性的（Ag得分-0.627），且非过敏，预测分子量大小为45.131 KDa。预测结果表明疫苗构建体结构是稳定的和呈碱性，其不稳定指数为23.46和理论PI值为9.01。该疫苗在哺乳动物网状细胞（体外）中的半衰期为30小时，而在酵母（体内）中为约20小时，在大肠杆菌（体内）中为10小时。构建的疫苗预测的二级结构包含42.33％的α-螺旋，22.09％的β-折叠，4.42％的β-转角和31.16％的无规卷曲。

疫苗构建体的建模，优化和验证

在前10个预测模型中，选择Z分数为7.61，模板为1dd3A的模型进行优化。ProSA-web工具使用-0.47的Z评分评估了优化模型的整体和局部质量，该评分接近相似大小的天然蛋白质的范围（图3）。此外，Ramachandran作图分析显示，在优势区域中有92％的残基，在允许区域中有6.1％的残基，以及1.9％的异常值。这表明预测的疫苗构建体的质量足以进行进一步分析。

连续和不连续表位的预测

BCpred2.0服务器预测了候选疫苗表面上的四个连续表位，即AKILKEKYGLD，EILDKSKEKTSFD，LKESKDLV和VPKHLKKGLSKEEAESLKKQLEEV（图S2），而IEDB预测了得分均高于0.8（表S16）的六个不连续的表位（图S3）。

构建疫苗与TLR3和TLR4受体的已的分子对接

Clusprov.2预测了30种疫苗受体TLR3复合物和TLR4复合物及其相应的簇评分的模型（表S17-S18）。在这些模型中，TLR3复合体中的2号模型和TLR4复合体中的1号模型被评为最佳对接复合体，其最低能量得分为-1199.1（46个成员），最低能量得分为-1229.9（79个成员） （TLR4）。这表明预测的疫苗构建体与TLR3和TLR4受体之间可能存在分子相互作用（图4）。

电子克隆和疫苗优化

Java密码子适应工具优化了疫苗的密码子使用，从而得到了长度为1290个核苷酸的优化密码子序列。优化序列的CAI值为0.95，接近1，GC含量为54.41％，介于30％到70％之间。因此，适应性良好，表明疫苗构建体在宿主大肠杆菌中具有潜在的表达能力。之后，将XhoI和NotI限制酶的限制序列添加到适配密码子序列的N和C末端。此外，还使用SnapGene工具将该序列克隆到pET–28（+）载体中（图5）。

疫苗构建体的免疫模拟

结果显示，C-ImmSim服务器生成的免疫反应与实际免疫反应一致（图6和S4）。最初的反应是由IgM水平的升高引起的。同样，继发性反应的特征是IgM+IgG，IgG1+IgG2，IgG1，IgG2和B细胞群体水平升高。在随后的疫苗接种中，抗原水平的下降表明了以免疫记忆形式出现的免疫原性反应。T细胞群体，即CTL和HTL，都产生了与记忆细胞相对应的免疫应答，这表明疫苗构建体中包含的T细胞表位具有免疫原性。在每次接种后也观察到巨噬细胞活性增加，而NK细胞的活性在整个期间都保持一致。在随后的接种中也观察到IFN-γ，IL-10，IL-23和IL-12的水平显着增加（图6）。在固定间隔后通过12次注射重复接种疫苗构建体后，IgM+IgG，IgG1+IgG2的水平显着升高。尽管IgG1略有增加，但IgM和IgG2却持续增加。在整个接种过程中观察到与B细胞和T细胞对应的记忆激增，而从第一次接种到最后一次接种，IFN-γ的水平始终保持较高水平（图S4）。这表明本研究中提出的疫苗在短时间接种的情况下产生了强烈的免疫反应，即使随后多次接种中免疫应答也会增强。

讨论最近在中国武汉市爆发的SARS-CoV-2引发了一些有关人类对这些新型病原体的敏感性的问题。正如先前对SARS-CoV新型变体的重新出现的预测，与以前的变体相比，SARS-CoV-2在短时间内病毒的广泛传播方面被证明具有更大的致死性。如此高的传播速度引发了人们对针对SARS-CoV-2的疫苗研发的追求，SARS-CoV-2目前是全球大流行病，有超过143万例病例和85,711例死亡。通过采取严格而全面的措施，疫苗的开发和应用可以在从人群中消除病毒或抑制个体与不同人群之间的传播方面发挥关键作用。因此，人们目前正在作出若干努力来应对当前情况下出现的挑战，并在对病毒生物学及其病因学的认识方面取得了可观的进步。缺乏有关免疫系统对病毒感染的反应的知识是SARS-CoV-2疫苗开发途径的主要限制因素。

这项研究是描述结构蛋白潜在免疫原性靶标的一次尝试，并提出了一种新的多表位疫苗结构，为疫苗开发的初始阶段带来了新的希望。遵循各种计算和免疫信息学方法，已对拟定的疫苗构建物进行了评估，如抗原性差，致敏性，对免疫细胞的亲和力低，自身免疫性和过大可能影响有效性的某些标准。检索到的结构蛋白及其抗原性评分表明，考虑到包膜蛋白在病毒装配中的作用，它是产生免疫反应的最有效蛋白。由于对任何病原体的免疫力都非常依赖，因此如何被B细胞和T细胞识别非常关键。我们在每种结构蛋白中鉴定了与B细胞和T细胞相对应的表位，因此接种疫苗构建体可以诱导体液免疫和细胞免疫的发生。拟定的疫苗构建体是根据以最可靠的标准的表位设计的，例如，它们的抗原性质，非过敏性质，在目标蛋白质中100％保守，对多个等位基因的亲和力，与任何人类蛋白质都不具有同源性，在全世界范围内覆盖人类（覆盖全球> 50％的人口），以及有效分子与它们各自的HLA等位基因相互作用。此外，IFN-γ表位在免疫调节、抗病毒和抗肿瘤方面同样有效，因此，在设计最终疫苗构建体时还考虑了IFN-γ表位以提高免疫识别能力。设计的具有430个氨基酸残基的疫苗的分子量为45.131K Da，也处于多表位疫苗平均分子量的定义范围内。不稳定性指数和理论PI也表明该疫苗本质上是稳定且呈碱性的，估计的半衰期表明该识别肽不具有较短的半衰期，并且在足以产生潜在免疫应答的跨度内仍将保持活力。疫苗模型的优化和验证表明，预测模型的质量良好，因为超过90％的残留物位于优选区域[55]。在疫苗表面预测的B细胞连续表位表明，疫苗能够被B细胞识别，表明其有效性。TLR3和TLR4在SARS-CoV和MERSCoV中都已被证明具有识别能力。考虑到SARS-CoV和SARS-CoV-2的相似基因组特征，通过对接分析，疫苗与TLR3和TLR4的分子相互作用表明，所构建的疫苗对Toll-like受体具有显着的亲和力，可作为传感器识别病原体的分子模式并启动免疫反应。因此，疫苗TLR复合物能够产生针对SARS-CoV-2的有效先天免疫应答。此外，密码子优化改善了重组疫苗在大肠杆菌中的表达。K12菌株具有显着的密码子适应指数和GC含量，表明其表达水平升高。在pET - 28(+)载体上成功克隆重组疫苗后，模拟产生的免疫应答表明，初级和次级免疫应答与实际预期应答一致。随后的三次注射接种表明疫苗具有产生记忆细胞的潜在能力，并且在以后接触冠状病毒时更有可能产生显著的免疫反应。持续高水平的IFN-γ也支持体液免疫的激活。为了了解疫苗的免疫原性潜力，以12次注射的形式进行了反复接种，结果表明可以持续产生强免疫反应。通过所有这些免疫信息学方法，针对SARS-CoV-2设计的疫苗在诱导免疫反应中显示出良好的效果。

在目前的情况下，如果没有适当的控制方法或疫苗，就很难遏制冠状病毒大流行。然而，几种药物已经针对SARS-CoV-2进行了测试，但没有一种药物显示出完全的有效性。在这项研究中，我们采用了一种疫苗经济学方法，使用多种计算机和免疫信息学方法设计了针对SARS-CoV-2的多表位疫苗。基于计算和免疫信息学方法，我们选择设计的疫苗具有诱导先天和适应性免疫系统的所有潜力，并且可以中和SARS-CoV-2，因此，必须对设计的疫苗进行实验验证，并由专业人士为其安全性，有效性和成功性评价。

原文来源：

Designing a multi-epitope peptide-based vaccine against SARS-CoV-2.https://doi.org/10.1101/2020.04.15.040618