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引物设计： 引物（primer）： 是DNA复制的起始点提供3′-OH，由一小段单链DNA或RNA构成。
DNA引物设计： PCR引物在聚合酶链式反应中，需要一对DNA引物，即正向引物（forwardprimer）和反向引物（reverseprimer）。正向引物是与DNA双链中无义链结合的引物，而反向引物是与有义链结合的引物。
引物设计原则：
- 引物与模板互补
- 引物与引物间避免形成稳定的二聚体或发夹结构
- 尽量避免引物在模板的非目的位点结合
探针设计
杂交探针（hybridizationprobe）:是人工设计的一段寡核苷酸，用于目的核酸的识别和检测。根据检测的需要，有些探针进行了标记（如生物素、地高辛、荧光分子、辣根过氧化物酶等）。探针类型：- DNA探针：即一段DNA片段。早期主要用于Southern印迹杂交，通过克隆基因、限制性内切酶获得特定片段制备DNA探针。也可通过PCR扩增或人工合成获得。
- RNA探针：指带有标记，能与组织内相对应的核苷酸序列互补结合的一段单链cDNA或cRNA分子。由于RNA是单链分子，它与靶序列的杂交反应效率较高。目前RNA探针主要有3种类型：① 单链cDNA探针：它可通过RNA逆转录获得；② cRNA探针：是以cDNA为模板，通过体外转录而获得；③ 寡核苷酸探针：以核苷酸为原料，通过DNA合成仪人工合成。
- 肽核酸（peptidenucleic acid，PNA）：是具有类多肽骨架的DNA类似物，PNA的主链骨架是由N（2-氨基乙基）-甘氨酸与核酸碱基通过亚甲基羰基连接而成的。PNA可以特异性地与DNA或RNA杂交，形成稳定的复合体。
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- 肽核酸（peptidenucleic acid，PNA）：是具有类多肽骨架的DNA类似物，PNA的主链骨架是由N（2-氨基乙基）-甘氨酸与核酸碱基通过亚甲基羰基连接而成的。PNA可以特异性地与DNA或RNA杂交，形成稳定的复合体。
探针设计- 探针的设计对杂交检测至关重要，它决定着检测的特异性。探针与目标核酸相互作用越强，探针检测的特异性越高。
- 影响检测特异性最重要的因素是探针的长度。目前，根据探针寡核苷酸的长度，可以分为两类：
长探针：其长度在500～5000 bp之间，靶序列上存在点突变或多态性也不影响其杂交检测，因而特异性和敏感性都能得到保障。短探针：其长度小于500bp，它对点突变或多态性的检测比较敏感。
探针标记（probelabeling）：是在核酸分子中标记信号分子用于检测分析。探针的标记方式主要有放射性标记和非放射性标记。其中32P是最常用的放射性标记。杂交条件优化：
如何提高信噪比，达到最佳目标核酸识别和检测效果，需要对杂交条件进行优化。
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发表于 2021-2-18 22:16:28
