作者：樊东东1 陈芊如1 王楠1 苏世圣1 彭衍科1 王芳2 刘宝霞2 王博2 白宇2 卢临萍2 祝令香2 杨文军2 郭永1单位：1.清华大学医学院生物医学工程系，2.北京新羿生物科技有限公司
【摘要】
2019年12月出现了一种新型的冠状病毒，该病毒具备极高的传染性和隐匿性，这使其在全球范围内迅速扩散，迄今已经有约1.5亿人被感染，超过300万人丧失生命。在疫情防控、感染确诊和临床治疗中，以PCR为代表的分子诊断技术发挥了巨大的作用，特别是在疫情初筛阶段，更是发挥了保障社会正常运转的作用。在PCR领域，数字PCR（dPCR）是一种新兴的PCR检测技术，具备绝对定量、灵敏度高、特异性好、抗干扰能力强等诸多优点。本文首先介绍了基于微液滴技术的dPCR的技术原理、检测的过程、以及微液滴技术赋予dPCR的优势。基于此，本文回顾了dPCR在新冠疫情中的研究进展。比如，基于绝对定量的能力可以研究样本类型中新冠病毒的含量、评估样本制备方法对病毒检出率的影响、进行新冠新药的临床评估；基于高灵敏性可用于低丰度病毒样本的检测、用于检测灰区的甄别等。随着研发的深入，dPCR的应用前景比较广阔。
2019年12月爆发了一种由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起的传染病1，该疾病已经在全球范围内持续流行了18个月之久。SARS-CoV-2与中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）、蝙蝠SARS样冠状病毒（SARS-like bat CoV）和严重急性呼吸道综合征冠状病毒（SARS-CoV）同属乙型冠状病毒支系，基因组分析发现，SARS-CoV-2与SARS-like bat CoV最为相近2。SARS-CoV-2基因组编码29个蛋白，其中结构蛋白由4个结构基因编码，包括尖峰（S）、包膜（E）、膜（M）和核盖体（N）基因；而非结构蛋白主要由ORF1ab基因编码2。由此病原体引发的传染病被命名为新型冠状病毒肺炎（COVID-19），COVID-19疫情影响全世界，截至2021年4月29日，约1.5亿人染病、超过300万人死亡 (https://coronavirus.jhu.edu/map.html)。
COVID-19的传染性极强，及时、准确的诊断对于治疗和疫情防控十分重要。当前主要以病毒RNA检测作为确诊COVID-19的方法，临床上应用最多的技术为实时荧光逆转录PCR（RT-qPCR）3。其他一些核酸检测技术也被开发用于SARS-CoV-2的检测，包括数字PCR（dPCR）、环介导逆转录等温扩增技术（RT-LAMP）、转录介导扩增技术（TMA）等4。其中，dPCR是继实时荧光定量PCR（qPCR）之后新发展起来的一种核酸定量分析技术，dPCR的具备高灵敏度、高精度和绝对定量等独特优势，在新冠疫情中被用于病毒的检测、定量、病情监测、新药评估等多种研究。本文将对dPCR的技术原理和优势进行介绍，回顾dPCR在新冠疫情中的应用，并尝试为dPCR在新冠疫情与相关临床应用中的改进和发展方向提出见解。
一数字PCR技术
1. 数字PCR技术原理：dPCR的原理是将PCR的反应体系离散为众多微小单元，然后通过对微小单元内反应结果的检测反映整个体系的原始模板拷贝数目。通常来说，dPCR包括微液滴式和微孔式，微液滴dPCR采用基于微流控的液滴技术离散整个反应单元5；微孔式dPCR主要采用微纳米加工技术将一片基材加工成包含数万个微反应室以实现反应单元的离散6。
以微液滴dPCR的SARS-CoV-2检测为例，图1展示了dPCR的技术原理和检测程序。首先是配制含有靶标检测引物和探针的混合液，通常使用特异性的TaqMan探针或者是非特异性的染色法标记技术，在SARS-CoV-2检测中多使用TaqMan法，以N基因和ORF1ab基因作为靶点。然后采用微流控芯片生成微液滴，液滴直径通常在90-120 μm，微液滴生成有十字法和T型通道法等，目前采用最多的是十字法，见图1b。生成的液滴存在三种状态：不含靶标核酸分子、含有单个靶标核酸分子、含有多个靶标核酸分子，在靶标分子丰度不高的情况下，液滴处于以上三种状态的概率遵从泊松分布。液滴后续被放置到热循环仪上进行扩增，这一步骤和普通PCR过程基本一致。经过扩增之后，原包含有靶标核酸分子的液滴内部的核酸量将达到百亿量级，靶标分子在扩增的过程中和荧光基团结合，使其能接受光信号的激发并释放荧光信号。之后，液滴将逐个通过光学检测位，不包含靶标分子的液滴的被激发光信号较弱，包含有荧光靶标分子的被激发光信号较强，见图1e。光信号通过一些例如放大、聚焦、过滤等的处理操作后被光电倍增管（PMT）转换为电信号，每一个液滴对应一个或多个信号峰值，峰值的高低和频段反映了液滴的状态。最终液滴的统计信息根据泊松分布转化为原始靶标分子的浓度，图1f展示了双重靶标dPCR的分析结果，图中散点的位置代表了携带不同靶标的液滴。
2. 数字PCR优势：绝对定量：qPCR通过计算扩增过程的荧光曲线的Ct值，并配合参考品同时扩增建立的标准曲线，对待测样本进行定量，而荧光曲线往往容易受到扩增效率、抑制剂、样本质量、系统误差等因素影响。与qPCR不同，dPCR将待测靶分子分散在数万甚至数百万反应单元中，并根据每个反应单元扩增反应终点的荧光强度进行阴阳性划分。dPCR的拷贝数计算依据阴阳性反应单元的数量和统计学模型，可对靶分子的数量实现精准的绝对定量，不容易受干扰，也不依赖于参考品。因此，dPCR能够提供更可靠和准确的定量结果。Hindson等人比较了dPCR与qPCR定量miRNA的能力，结果显示dPCR能够提供比qPCR更精确和更高重复性的定量结果7。
更高的灵敏度：dPCR技术对整个反应体系进行万倍以上的离散，由于背景模板被大量的反应单元所分割和稀释，在含有目标模板的反应单元中，背景模板的数量呈数量级减少（比如将PCR体系分割为10000个反应单元，则每个反应单元内的背景模板的数量被减少4个数量级），因此PCR扩增时目标模板受到的非特异性干扰也呈数量级地减少，从而保证目标模板的特异扩增。因此dPCR能提供更高的灵敏度，使得在大量背景模板的干扰下对稀有靶标检测变得可能。如在BRAF V600E稀有突变的检测中，dPCR和qPCR分别能够检测到0.001%和约1%的突变比例8。
更好的稳定性：较大数量级的离散使得原先在反应体系中存在的一些抑制剂也被分散至各个微反应单元中，此举大大减少了每个反应单元内的抑制剂总量，使得dPCR对抑制剂的抗性增强。在一些病毒（如巨细胞病毒）检测体系中，即便抑制剂可以影响PCR的扩增，但是影响程度相对qPCR较小，并且受影响的液滴也仍然可以通过比对其荧光信号强度与阳性信号阈值进行正确判定9, 10。
更高的精度：dPCR的定量原理决定了其比qPCR具有更高的定量精度。在qPCR中，由于荧光信号在每个循环中都会加倍，因此一次检测通常只能解析两倍的拷贝数差异；在dPCR中，通过将反应体系进行离散以及检测扩增反应后每个反应单元的荧光信号，理论上可以达到定量单个分子的效果。可以通过将反应体系分割为更多反应单元来提高精度。例如在人类巨细胞病毒的定量检测研究中，结果显示dPCR的定量变异系数小于qPCR的，在10000拷贝/mL和1000拷贝/mL的水平dPCR的变异系数较qPCR的分别减少4倍和1.5倍11。
二数字PCR在COVID-19 疫情中的应用
1. 高灵敏度新冠核酸检测：RT-qPCR虽然是目前COVID-19诊断的金标准，但其被报道存在假阴性率高的问题12, 13。假阴性结果可能由多种因素造成，包括引物和探针靶区域突变、样本中的病毒量不足、采样过程不规范、运输不当和样本中存在扩增抑制剂等14。由于dPCR技术具有高灵敏度和较好的抑制剂抗性的特性，其应用于检测SARS-CoV-2时能够有效的减少假阴性结果。研究人员比较了基于dPCR和RT-qPCR的SARS-CoV-2检测方法的最低检测限（LoD），结果表明dPCR的方法具有更低的LoD和更高的灵敏度15-17。在临床样本的检测中，dPCR也表现出比RT-qPCR具有更高的灵敏度，部分RT-qPCR检测为疑似或阴性的COVID-19样本，dPCR都成功检测出阳性15, 17-21。在Suo等人15的研究中，26例COVID-19确诊患者的样本被dPCR成功检出，而这些样本的RT-qPCR检测结果均为阴性。此外，Falzone等人16的研究也显示dPCR对扩增抑制剂的作用较不敏感。由此说明，dPCR在低病毒载量样本的检测中具有优势，能够作为RT-qPCR的补充。
2.临床样本类型病毒载量评估：COVID-19临床样本的取样部位和类型很多，包括鼻拭子、咽拭子、痰液、血液、尿液、粪便、支气管肺泡灌洗液等等。选择合适的临床样本有助于进行准确的临床诊断，对疾病防控和治疗有重大意义。因此，有必要评估各个类型的样本的病毒载量，尽可能选择病毒载量最多的样本以提高检出率。Yu等18使用dPCR定量鼻拭子、咽拭子、痰液、血液、尿液中的病毒载量，结果发现痰液中具有最高的病毒载量，鼻拭子和咽拭子次之，提示了以痰液作为检测样本能够提高阳性检出率。但是鼻、咽拭子的样本都需要专业的医护人员获取，采样便利性不及唾液，因此不断有研究人员验证唾液检测病毒的可靠性。
Sui等22对35个无症状但核酸阳性的病人采取了183份样本样类型包括唾液、痰液、鼻咽拭子和口腔拭子，检测结果显示唾液的阳性检出率仅仅比鼻咽拭子略低一点，高于其他类型的样本，并且相对其他样本，能够提供更低的假阴性率。Li等23采用数字PCR对鼻咽拭子、肛周拭子、唾液等不同类型的样本进行了定量检测，结果显示鼻咽拭子能够提供最高的检出率，而肛周拭子仅次于鼻咽拭子，检出率为24.3%，这为新冠病毒检测的样本类型提供了一种新的可能。以上研究表明dPCR的绝对定量能力在COVID-19临床样本评估、病毒定量中发挥重要作用。
3.样本制备方法评估：为了保护医学实验室人员免受感染，大多数实验室在检测前会对临床样本进行灭活处理。然而，灭活处理可能会对检测带来影响，导致假阴性结果，因此有必要明确样本前处理对检测结果的具体影响。Chen等人24使用dPCR定量3种灭活方法处理前后样本中的病毒量，结果显示灭活处理减少了可检到的病毒量，并可能因此导致假阴性结果，其中热灭活的样本中病毒拷贝数大幅下降，使用TRIzol试剂对RNA拷贝数的影响最小。dPCR在核酸样本灭活处理的评估中发挥了其绝对定量的优势，同样的方法能够用于其他影响因素的研究。
4.病情进展动态监测：在临床管理与治疗中需要对患者的病情进展进行监测，其中病毒载量通常与病情的严重程度相关。Yu等人18利用dPCR定量患者不同时期的样本中的病毒载量，发现在早期和进展期的病毒载量明显高于恢复期的病毒载量，提示动态监测样本中的病毒载量有助于评估疾病的进展。Szwebel等25发现SARS-CoV-2核酸病毒血症可以作为监测新冠抗IL6受体治疗过程的特异性标志物，因为该疗法效果个体差异性较大，因此可以通过dPCR检测这一标志物来筛选符合条件的患者。这类研究说明dPCR高灵敏度与精确定量的特性使其能够胜任患者感染病毒后，病情发展、治疗等过程中病毒载量变化的监测。
5.核酸参考品制备：在 SARS-CoV-2的核酸检测中，核酸参考品被用于评估检测方法的性能、制作RT-qPCR定量标准曲线以及作为阳性对照。van Kasteren等人26使用dPCR定量病毒RNA拷贝数并对样本进行系列稀释，以系列稀释液评估不同RT-qPCR试剂盒的检测灵敏度。Fung等人27通过dPCR定量病毒核酸，制备系列稀释液，以此测定七种SARS-CoV-2检测方法的检测下限。此外，在Hu等人28的研究使用dPCR标定的系列参考品评估单、双、三靶标的新冠qPCR体系，结论进一步得到了采用经dPCR定值的57分临床样本的验证。dPCR绝对定量的优势使其能够满足核酸参考品制备的需求，即对核酸进行精确的定量。对于中检院和国家计量院制定新冠国家核酸参考品来说，dPCR是一个必不可少的工具，并且发挥了重要作用；对于从事新冠检测的企业制备核酸企业参考品，也是同样的重要。
6.环境中SARS-CoV-2监测：COVID-19的传染力强，了解病毒的传播方式与环境中病毒的分布，有助于指导疫情防控策略的制定。由于从不同环境中得到的样本质量不一，这就对病毒的检测提出了高灵敏度及强抗抑制剂干扰性的要求。Liu等人29通过dPCR定量COVID-19爆发期间武汉两家医院不同区域气溶胶中的病毒RNA，隔离病房和通风的病房中检测到的病毒RNA浓度非常低，但在患者使用的洗手间和某些医务人员区域检测到较高浓度，结果显示SARS-CoV-2具有通过气溶胶传播的潜力。Lv等人30利用RT-qPCR和dPCR检测样品运输和接收设施、测试仪器、个人防护设备等实验室相关物体表面上残留的病毒。RT-qPCR检测结果均为阴性，而dPCR在61个样品中检测出13个SARS-CoV-2阳性。SARS-CoV-2核酸密度最高的区域是操作员的外手套，其余操作员戴着手套的手直接或间接接触的物体也检测出病毒，表明手接触是导致实验室环境污染的主要传播途径。基于dPCR能够灵敏检测与定量环境中的病毒RNA浓度，由此为防疫措施与消毒程序提供参考依据。
7. SARS-CoV-2突变检测：RNA病毒的突变率非常高，高突变率与毒力调节和进化能力相关，病毒突变研究对于评估病毒耐药性、了解免疫逃逸和发病机理相关的机制至关重要。通过基因测序和比对能够获得病毒变异的基因组信息，但要在实验室样品与临床样品中检测出已知的SARS-CoV-2遗传变异则需要灵敏度更高的技术。Wong等人31开发了一种基于dPCR的检测方法来检测Vero-E6传播的分离株、类器官、实验感染的仓鼠和COVID-19患者样本中的PRRA位点或位点上游缺失变异。他们发现PRRA缺失的蝙蝠状冠状病毒变异体可以在COVID-19患者中自然存在，而且仍然可以传播，但这些变异在自然感染中的频率较低，表明它们的竞争性不如插入PRRA的野生型。dPCR对模板进行稀释和分割，使其能够更加精准、灵敏捕捉是否存在突变型核酸，适合用于已知的SARS-CoV-2遗传变异检测，特别是是对于一些低频突变。
8.抗SARS-CoV-2新药的评价：在抗病毒药物的研发过程中，病毒载量的变化是评估药物有效性的重要指标。例如，在remdesivir针对成人重症COVID-19患者的一项研究中，Wang等人32对受试者的呼吸道样本的病毒载量进行检测以明确药物是否能够加快病毒载量下降或降低病毒检出率；在arbidol和lopinavir/ritonavir治疗药物的比较研究中，Zhu等人33通过病毒载量的变化来评价药物的效果。这两个研究都使用RT-qPCR来测量病毒载量的变化，其中Wang等人通过标准曲线确定病毒载量，Zhu等人仅使用Ct值来表现病毒载量的变化。由于dPCR能够实现不依赖标准曲线的绝对定量，而且能够检测到拷贝数的微小差异，笔者团队辅助多家药厂采用dPCR进行新冠新药的临床评价（尚未发表），认为dPCR比RT-qPCR更适合用于评价抗SARS-CoV-2药物的有效性，能够给出更具说服力和准确的评价结果。
三总结和展望
dPCR将核酸模板稀释、分配到大量独立的微反应单元中进行扩增反应，不仅可以对样本进行绝对定量，针对低丰度的样本，还能提供更加灵敏和特异的性能，对扩增抑制剂的抗性更强。本文综述了dPCR在COVID-19疫情监测、防控和临床治疗等过程中的应用，如低拷贝病毒样本检测、临床样本病毒载量定量、参考品标定、环境中病毒浓度定量、病毒突变检测等，这些应用也恰恰是其绝对定量、灵敏度、特异性高等优势的体现。
虽然dPCR的优势与临床应用前景已在许多研究中得到确认，但想要进一步在临床广泛应用，甚至在各级医疗单位包括疫区与基层医院推广使用，dPCR仍面临一些挑战。首先是dPCR的动态范围受限于离散液滴数的限制需进一步提高，通常能做到的上限一般在106量级。其次，商用dPCR系统目前的检测通量仍然有限，无法充分满足COVID-19普筛的需求，需要进一步提升样本检测通量。再者，dPCR的临床实验室标准仍不成熟，需要制定国家或行业统一标准，推出商品化的质控品；最后是dPCR设备成本较高，目前可选择的商用dPCR平台有限，并且推出的临床可用的试剂盒数量较少，这些都需要行业的共同推进和努力。总之，随着研究和行业的持续深入，未来dPCR在实验室或医院中的应用前景，非常值得我们共同期待。
致谢：感谢北京市科学技术委员会科技计划（Z201100005420025 ）和清华大学春风基金滚动支持课题（2020Z99CFG010）对本研究的基金支持。本研究成果发表于《View》期刊2021年第2期（Applications of digital PCR in COVID-19 pandemic: https://doing.org/10.1002/VIW.20200082），感谢《View》编辑部许可将英文原稿翻译成中文并根据研究进展更新后发表于本期刊。
参考文献略
注：本文来源于《临床实验室》杂志2021年第5期“分子诊断”专题
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发表于 2021-6-5 21:59:28
