体外诊断试剂校准品，作为一种校准特定测量系统的参考物质，应当有具体的量值和已知的测量不确定度。因此，为校准品赋值，并保证该量值能实现计量学溯源是校准品生产企业的一项重要研究工作。本文主要基于计量学溯源标准，从注册技术审评的角度分析校准品厂家的溯源工作现状，并针对存在的问题提出改进建议。
根据计量学溯源标准给出的定义，校准品是具有在校准函数中用作独立变量值的参考物质。而现行法规《体外诊断试剂注册管理办法》从产品预期使用风险的角度，对体外诊断试剂校准品明确了分类管理，即与二、三类体外诊断试剂配合使用的校准品，则按对应试剂的类别进行管理，与一类试剂配合使用时，要按二类产品管理。然而，即便法规赋予的风险管理类别有所不同，其赋值准确度和实现计量学溯源的要求却是等同的。因此，体外诊断试剂校准品生产企业均应严格根据分析物特点和国内外指南及标准承担起校准品的量值溯源研究工作。
近年来，试剂厂家明显重视和规范产品校准品的溯源工作，这得益于法规体系的不断完善和与国际标准接轨进程的推进，从监管和技术两方面促进了该项研究工作的发展。
1，从法规层面明确溯源工作的要求
现行《体外诊断试剂注册管理办法》中有明确规定：中国食品药品检定研究院负责组织国家标准品、参考品的制备和标定工作，当中对国家标准品的制定工作明确了责任主体和提出了要求，从而推进了国家标准品的制备工作，为校准品溯源提供参考物质基础。另外，国家食品药品监督管理总局在2014年发布的第44号文中明确提出：校准品应提交完整的溯源性文件。由此，作为上市前评估校准品有效性的证明性文件，生产企业则不可避免地重视起校准品的溯源工作。
2，国内外标准实施规范了溯源工作
国际标准化组织于2003年发布实施ISO17511体外诊断医疗器械生物样品中量的测量校准品和控制物质赋值的计量学溯源性、ISO18153体外诊断医疗器械：生物样品中量的测量：酶催化浓度校准物质和控制物质赋值的计量学溯源性等标准，有利于指导和规范各国标准物质的计量学溯源工作。而国内也对上述两个标准进行了转化，于2008年开始实施GB/T21415-2008体外诊断医疗器械生物样品中量的测量校准品和控制物质赋值的计量学溯源性，另外YY/T0638-2008体外诊断医疗器械生物样品中量的测量校准品和控制物质中酶催化浓度赋值的计量学溯源性、JJF1059.1-2012测量不确定度评定与表示、YY/T1455-2016应用参考测量程序对酶催化活性浓度赋值及其不确定度评定指南等相继发布，不仅对量值的传递途径进行了规范，还对具体赋值的不确定度等内容提供了研究方法。
3，溯源工作研究情况
基于国内外标准的支持，从校准品厂家提供的注册申报资料-溯源性文件可以看出，厂家对校准品计量学溯源的认知有所提高，研发过程基本能依据计量学溯源标准和相应指南逐步规范溯源性文件。目前生产企业主要依据GB/T21415-2008来开展校准品溯源工作的研究，下面则从溯源文件中包含的三部分内容来阐述校准品厂家的溯源工作情况。
3.1校准传递方案的选择
通过对校准品的溯源性文件分析得知，目前相当一部分校准品厂家会选择GB/T21415-2008标准中5.6的情况进行溯源，即溯源链的终端为制造商选定的测量程序，即便分析物已经有国际约定的参考物质或参考方法。选择此方案一方面是厂家从可获得性和成本方面考虑，但从量值传递本身而言，会带进更多系统和操作因素的影响（因为厂家未必都完全了解选定的测量程序），不利于赋值和不确定度的评定，为保证校准品量值的准确性和互换性，应尽可能溯源至分析物现行的最高计量级别；另一方面原因是客观存在的，分析物目前国际尚无约定参考物质和参考方法，在计量水平上只能溯源至选定的测量程序，以自身抗体相关分析物较为常见。另外还有较为普遍的情况是，分析物如国家已明确了具体的参考方法或有标准物质的，厂家一般能选择其作为溯源链的终端，如《全国临床检验操作规程》中有明确，血红蛋白的结果无论采用何种原理检测，均应溯源至ICSH推荐的氰化高铁血红蛋白分光光度法，而WS/T341-2011血红蛋白测定参考方法中则详细介绍了该参考方法。另外卫生部颁布很多如WS/T417-2013γ-谷氨酰基转移酶催化活性浓度测定参考方法、WS/T349-2011α-淀粉酶催化活性浓度测定参考方法等标准均有指定了具体分析物质的参考方法。因此，校准品厂商在研发阶段可根据分析物具体的情况，尽可能结合临床实验室中的校准方案、相关标准及参考物质可获得性等方面去选择校准传递方式，从而建立和保证分析物的计量学溯源。
3.2赋值及测量不确定度的研究
标准GB/T21415-2008指出：校准品应具有赋值和已知的测量不确定度，也可理解为在量值传递过程每一级别的校准品均应有对应赋值结果和测量不确定度。通常，厂家申报的校准品在溯源链中属于产品校准品的等级，也是提供给终端客户如医院实验室用来校准检测系统用。目前国产已注册的校准品预期用途基本是明确与厂家自己的检测系统配套使用，故赋值和不确定度通常围绕常规测量程序（配套的体外诊断试剂和检测仪器）来进行研究，相应地用户在使用过程根据说明书预期用途，局限在对配套的检测系统进行校准，这也是国内商业化校准品的短板，目前校准水平尚未达到如朗道、伯乐等知名厂商的校准品，其赋值结果可校准不同的测量系统。这除了与校准品的计量学溯源有关外，还与校准品原材料的稳定性和纯度密切相关。
本部分阐述的赋值，是对产品校准品的赋值，是用高一级参考物质校准常设测量程序后，用该常设测量程序检测产品校准品得到一组结果，该结果可通过统计学处理（中位数或均值等）或修正最终成为固定的量值，而测量不确定度则是表征该量值分散性的非负参数，在临床上可以用来表征检测真值的分布范围，对于辅助临床检验结果的解释具有重要意义。另外根据标准GB/T21415-2008要求：制造商应提供赋值的不确定度，因此，厂家除了提供校准品具体的量值外，还应报告该赋值下的测量不确定度，以保证临床检验结果的准确性。从注册申报的溯源性文件可知，目前厂家均能提供赋值和测量不确定度研究的具体过程，但针对不确定度的研究与相关标准和指南的要求尚存在一定差距，主要体现以下方面：
（1）未明确不确定度的评定方法：不确定度的评定方法有“GUM”法、“自上而下”法、“蒙特卡洛”（MCM法）等，目前大部分厂家会选择前两种方法，评定方法通常与测量模型、数据分布情况有关。基于“GUM”法的具体研究流程可以参考标准JJF1059.1-2012，MCM法则可参考标准JJF1059.2-2012来评定。目前提供的不确定度研究资料中，最为典型的情况是研究方案中未明确评价不确定度所使用的方法，而直接得出校准品的测量不确定度=校准品赋值过程标准差的结论。
（2）片面识别和错误归类测量不确定度的来源：测量不确定度通常由多个分量组成，是基于正确定义被测量物质后（包括组分、制备方法和检测原理等），识别整个测量过程的影响因素，进而将重要的影响因素作为不确定度的来源，贡献量小的因素忽略不计的过程。识别不确定度来源的原则是不遗漏且不重复，获取不确定度的分量主要步骤为：①采用因果图作为识别工具来确定各不确定度分量的来源；②将纳入的不确定度来源进行分类评定（即标准不确定度A类评定和B类评定）；③根据不同分类采用不同的方法或测量模型量化具体的不确定度分量。目前厂家识别测量不确定来源不充分主要体现在未针对被分析物和测量流程考虑影响因素，如所有的分析物均只考虑校准品的不均匀性和不稳定性引起的不确定度，未充分考虑测量分析前对分析物的制备、分析中测量系统操作和分析后数据修约和统计等引起的不确定度。另外，在卫生部标准关于不确定度评定指南中有提及，酶类分析物基本都应考虑温度和pH两个分量作为不确定度的来源。
此外，溯源性文件存在的问题还体现在容易错误归类不确定度的来源，主要原因是对标准不确定度A类评定和B类评定定义理解不准确，或认为归为B类评定后可以避免大量复杂的统计工作，直接可参考经验数据等信息即可，这样往往导致计算不确定度分量时的结果差别较大。
3.3互换性研究
为了实现不同常规测量系统间测量临床样本的结果具有可比性，也为了判断校准品量值的正确传递，制造商需要在溯源工作中进行校准品的互换性研究。
根据溯源性文件中的互换性研究情况分析，主要总结以下两方面：
（1）互换性的判断标准各异：评价两个测量程序之间的测量结果是否具有互换性，首先应确定互换性的判断标准。而从资料可知各厂家依据的判断标准有所不同，大致可归纳为：①依据EP9-A3指南，经校准品校准后的常规测量程序与参考测量程序测量的两组测量结果之间是否具有显著性差异来判断；②根据EP14-A3或《WS/T356-2011基质效应和互通性指南》，校准品的测量结果是否落在参考测量程序和常规测量程序检测结果回归方程的95%预测区间内；③依据IFCC互换性评价更新方案，校准品在参考测量程序和常规测量程序间的偏移±不确定度是否小于该项目的医学允许偏移。上述判断标准选择均有一定的依据，但也有研究表明，相同的分析物如用不同的标准进行判断时，会出现不同的结论，目前EP14-A3、IFCC方案的评价标准是临床实验室中较为常用的判断标准。
（2）验证互换性的样本考虑不足：根据标准GB/T21415-2008的要求，互换性应使用参考测量程序和常规测量程序同时检测一组相关的人体样本，以评估校准品的互换性。目前厂家选择样本存在的问题主要体现在：①选择的样本为添加纯品的样品，非标准要求的天然真实样本；②样本例数无统计学意义；③样本浓度分布过于集中，未覆盖测量系统的可测量范围；④重复使用赋值过程的一组人体样本来进行互换性研究；⑤未经评估而选择大量冻存样本。
4，改进建议
针对文中提及校准品溯源工作现状的不足及校准品校准测量系统的局限性，提出以下建议供参考：
（1）生产企业尽可能收集和学习计量学溯源相关标准和指南文件：目前的标准和指南基本比较完善，针对比较复杂的研究与统计方法附录已给出对应的例子作为对照理解，可操作性更强。另外更有专有产品的对应指南供作参考，如酶类物质，因此，校准品生产企业基本能从标准和指南中得到具体的规范指导。
（2）校准品应溯源至当前最高计量水平，提高校准品的量值准确度：目前部分厂商的溯源工作还停留在为符合注册审评审批的最低要求，出于成本和缩减上市时间考虑，往往选择市面普通的上市同类产品测量系统作为溯源的终端，会造成校准品水平参差不齐，且局限在校准本检测系统中使用，甚至到临床使用中出现检测结果互换性不过关的情况。因此，建议针对该情况，如校准品不能溯源至国际单位制（SI），也尽可能选择最高参考物质或参考方法作为溯源终端，另外选择参考物质应来源正规，保证参考物质的正确性。
（3）建议生产企业积极参与到临床实验室的室间评价工作：据了解，国内已有不少生产企业积极参与到临床实验室的室间评价工作中，这对验证产品检测结果准确性和提高企业检测能力具有重要的意义，尤其对计量学溯源过程不确定度评定析、互换性评价等方面获得临床使用上的指导意见。
（4）建立收集用户端校准结果的数据库：建议生产企业借鉴知名厂家的做法，开发常规测量系统时能考虑自动收集临床用户端使用过程的校准、质控数据，或为客户端定期进行校准等方面的数据，集成一个回顾性分析数据库，对以后评估测量系统的检测水平和不断分析改进提供研究和分析基础。
（作者：梁春滢，李小江，陈虹蓁 广东省药品监督管理局审评认证中心，广东广州510080）
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发表于 2021-8-24 22:11:25
