PCR是众所周知的分子生物学技术之一。20世纪70年代，研究人员首次报道了使用合成引物和DNA聚合酶从模板复制单链DNA。然而直到1983年，Kary Mullis才发明出用于扩增目标DNA的研究工具，就是我们今天所熟知的PCR方法。从此以后，PCR成为分子生物学研究必不可少的一部分，被广泛应用于基础研究、疾病诊断、农业检测和法医调查等领域。
1基因表达
通常可通过PCR来检测不同细胞类型、组织和生物体在特定时间点的基因表达差异。首先，从目标样品中分离出RNA并将mRNA逆转录成cDNA。随后，通过由PCR扩增的cDNA数量，确定mRNA的初始水平。这一过程也被称为逆转录PCR， RT-PCR。
终点PCR 可通过凝胶里的扩增产物条带强度对RNA的表达进行定量（一种半定量方法）。例如，对起始cDNA进行连续稀释并扩增。通过凝胶电泳使不同起始量的终点PCR得率可视化，然后对条带强度进行定量，并以管家基因为参照进行标准化，预估扩增靶点的相对表达水平。如今，终点PCR已基本被实时PCR 或qPCR 取代了，因为它们可获得更可靠和更准确的基因表达定量结果。
2基因分型
PCR可用于检测特定细胞或生物体中等位基因的序列差异。例如，基因敲除和敲入小鼠等转基因生物的基因分型。引物对经设计位于目标区域侧翼，可根据是否存在扩增子及扩增子长度来检测遗传变异。
但是如果为了检测特定核苷酸突变，则必须对扩增的序列进行进一步分析。例如， PCR扩增子测序就是研究单核苷酸变异（SNVs）和单核苷酸多态性（SNP）的方法之一。强烈推荐使用高保真DNA聚合酶，以防止在PCR过程中引入多余的突变。
通过PCR进行基因分型也是对癌症和遗传病中的突变进行遗传分析的一个基本方式。
3分子克隆
PCR被广泛应用于目标DNA片段的克隆，该技术被称为 PCR 克隆。在直接PCR克隆中，DNA（如，gDNA、cDNA、质粒DNA）的目标区域被扩增并插入到特殊设计的兼容载体中。
除了制备插入片段，PCR也是一种在在克隆后筛选克隆是否携带目标插入片段的有效方法。引物经过设计，可以用于确定载体中插入片段是否存在和插入方向。
4突变
PCR克隆的一大优点是能够通过克隆将所需突变引入目的基因中，以便进行突变研究。在 定点突变中，经过设计的PCR引物可将碱基置换、删除或插入整合到特定序列中。如 图5所示，引物定位到已克隆至质粒中的序列上。随后，含有引入突变的PCR产物通过自我连接，重新生成环状质粒，并用于转化感受态细胞。
5甲基化
PCR可用于研究位点特异性甲基化。在 甲基化特异性PCR（MSP）方法中，设计了两个引物对，以区分目标位点的甲基化状态。
首先使用重亚硫酸盐处理DNA样品，将未甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U）。重亚硫酸盐处理不会影响甲基化的胞嘧啶(m5C) 。为了检测甲基化位点，一对引物经设计 带有 鸟嘌呤（G），可与目标序列中的 m5C 配对；为了检测未甲基化位点，另一对引物带有腺嘌呤（A），可与重亚硫酸盐转化分子中的U配对（随后，与后续PCR循环中的胸腺嘧啶（T）配对）。通过引物配对得到的阳性PCR扩增结果可用于确定位点的甲基化状态。
甲基化研究中所使用的DNA聚合酶除了能够扩增富含AT的序列，还必须能够读取识别重亚硫酸盐处理后DNA中的U残基。而高保真DNA聚合酶含有来自于古细菌起源的尿嘧啶结合域，所以不适用于MSP（除非经过特殊修饰）。
实时PCR 可代替终点PCR，为MSP提供更准确的甲基化定量分析。利用实时PCR，对PCR扩增子的熔解曲线分析是检测目标位点甲基化状态的一种替代性PCR方法。
6测序
PCR是为测序富集模板DNA的一种相对简单的方法。为保证DNA序列准确性，强烈建议使用高保真PCR来制备测序模板。
在 Sanger测序中，PCR扩增片段经纯化并用于测序反应。使用常用的测序引物结合位点（如M13或T7“通用引物”结合位点）对PCR引物的 5′末端进行标记，以简化测序工作流程。
二代测序 （NGS）中，PCR被广泛用于构建DNA测序文库。在NGS文库制备中，DNA样品通过PCR反应富集（在起始量有限的情况下）并使用adaptor（以及用于多重检测的index）标记（图 9）。除了具有高保真度，DNA聚合酶还应具有最小的扩增偏好性，从而使测序文库具有高覆盖度。
7医学、法医学和应用科学
PCR技术不仅可用于基础研究，还适用于日常的临床诊断、法医学调查和农业生物技术研究。这些应用要求可靠的性能、卓越的灵敏度和严格的标准。因此，所使用的PCR仪和PCR试剂必须符合这些要求和目的。
分子诊断应用包括基因检测、致癌突变检测以及感染性疾病检测。在法医学中，利用 PCR进行人类身份鉴定是通过对独特的短串联重复序列（STR）进行扩增而区分个体的。在农业学中，PCR在食物病原体检测、育种植物基因分型和 GMO测试中具有重要作用。 ------------------------------------------------------------------------------
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发表于 2021-10-12 21:40:12
