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新冠过后,爆火的核酸分子检测产品,何去何从?

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发表于 2021-12-16 22:24:49 | 显示全部楼层 |阅读模式

新冠疫情爆发至今,已近两年,回看那些梭哈新冠检测试剂的企业,有的混得风生水起,有的活得并不如意。能以此为机遇的企业,或以黑马之势奔向行业前列,或以东山再起之态笑傲江湖。期间,新冠核酸分子检测产品,从靶标设计到灵敏度要求,从检测时长再到收费标准,无不影响着企业发展的方向。

1.单靶标与多靶标

病原体靶标的选择需具有特异性,即检测区域需为高度保守的核酸序列,为病原体所独有。一般情况下,选择病原体的单个特异性基因序列作为靶标,设计对应的引物探针即可。

而在国内获批的新冠核酸检测产品中,均是基于其开放读码框1a/b(open reading frame 1ab,ORF1ab)、包膜蛋白(Envelope protein, E)和核壳蛋白(Nucleocapsid protein, N)选择检测靶标的,其组合主要有单靶标(ORF1ab或N)、双靶标(ORF1ab和N)以及三靶标(ORF1ab、N和E),其中以双靶标检测产品最多。

实际上,在新冠病毒序列公布后,国家卫健委印发的《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南》里,即推荐了选用ORF1ab和N基因两个区域进行检测。再到后来,《新冠病毒样本采样和检测技术指南》里,又对单靶标阳性的检测结果提出了“重新采样、重新检测”的要求。从中,或许可以看出推荐双靶标检测的原因,一是为了防止漏检、二是为了提高准确性。另外,新冠作为一种RNA病毒,在复制过程中产生变异的几率相对较大,期间时不时出现的变异株也确实证明了这一点。当变异位点出现在引物或探针设计的位置时,则可能造成产品性能下降,导致检测结果出现假阴性。而双靶标设计的产品,则兼顾两个不同基因,其中一个基因漏检,还有另一个基因确保检测结果的准确性。此外,ORF1ab基因特异性优于N基因,而N基因的检出率高于ORF1ab基因,该两个基因特性的互补,在结果检测上具有双重保障,这也便体现出了多靶标检测的优势。

那么,检测一个病原体时,其靶标设置是否越多越好呢?

答案显然不是。目前新冠核酸检测产品中,在多靶标检测方法上,绝大多数采用了单管多重检测。在单管反应体系中,引物探针越多,其相互干扰的可能性就越大。这样,本想着增加靶标检测位点以提高检出率,最后结果可能会适得其反。而且,单个病原体采用多靶标检测时,其判读方法会更加复杂,复检的概率也会增多,最后可能在检测性能和使用体验上难以两全其美。而单靶标检测产品,只要选择的靶标特异性和灵敏度合适,也同样可满足需求。单靶标反应体系中,其靶标可控性也更强,受其它靶标的干扰较少,测试优化时间相对较短,而且理论上,单靶标的检测灵敏度也将更高。

但不管怎样,经此一役,多重检测必成分子诊断企业的基础技术储备,也终将成为分子检测产品的高级配置。因为,不管是对单个病原体的多靶点检测,还是对不同病原体的多重检测,单管多重的检测方法均是值得深入探索的。

2.高灵敏与防污染

新冠产品在早期开发阶段,市场对灵敏度的要求并未有明确规定,而企业也就更多地将最低检出限保守地确定为1000 copies/mL,其原因一方面是还未有标准品进行定标确认,另一方面也还不清楚市场的实际需求。最后,随着测试验证数据的增加,也在市场需求的驱动下,高灵敏核酸检测试剂越来越被关注,检测限≤500拷贝/mL也就成了企业产品灵敏度的一个要求。目前国内获批的新冠核酸分子检测产品中,检测限最低为100 copies/mL(华大单靶标),大部分产品最低检出限为200~500 copies/mL。

从检测原理看,当荧光PCR的检测极限为一个确定数值时,为了提高检测灵敏度,最直接的方法就是增加反应体系中的靶标数量。

例如,对于一个浓度为500 copies/mL的样本,取200μL进行核酸提取,并加入100μL洗脱收集核酸,最后取10μL核酸洗脱液加入反应体系中,通过计算可知道反应体系中的模板量理论为10copies。

基于此操作过程,在反应体系检测能力固定的条件下,若想进一步提高灵敏度,则可对样本前处理和操作流程进行优化。不管是增加样本上样量,还是减少洗脱体积,抑或提高洗脱产物加入量,这些单一方面的改进,皆可直接提升反应体系中的靶标数量,从而提高体系对样本的检测灵敏度。而这些改进方法,在提供整体解决方案或一体化检测系统的厂家中,其实现的方式将更加容易,兴许正因如此,新冠也顺便带火了整体解决方案和一体机。

然而,高灵敏的试剂,在操作不当时,也更易因污染造成的假阳性而困扰。在国内“动态清零”的大背景下,一有散发疫情,便是全员核酸检测,如此大规模的核酸筛查工程,高灵敏试剂对疫情防控的意义不言而喻,但一旦出现污染,其后果也是不堪设想。

虽然在国内对分子检测实验室明确要求分区设置,以确保生物安全性和检验质量,但作为产品的设计者,企业在产品开发时,就应从使用者角度出发,降低潜在的产品使用风险。例如,在反应体系中加入UNG酶,以降低扩增产物污染造成的假阳性;又或者,采用半自动或全自动仪器进行检测时,利用合理有效的设计,以防止污染产生。

实际上,在分子诊断行业,总不乏更高灵敏度的检测方法推出,但其实际应用价值还需进一步考察。其中,灵敏度、特异性和防污染能力的相互协调,便是关键因素之一。

3.内源性内标与外源性内标

核酸分子检测体系中,除了靶标之外,还有用于监测反应体系的内标。内标有内、外源之分,内源性内标常为人源性管家基因,可伴随样本的采集而进入检测体系;外源性内标则是人工添加的样品,可为人工合成的基因片段、无感染性的假病毒或病毒颗粒。

在《2019新冠病毒核酸检测试剂注册技术审评要点》中,即已要求内标应与靶核酸一同提取及扩增,因此无论是内源性内标,还是外源性内标,两者均需参与提取检测,以对提取或扩增异常导致的假阴性结果进行质量控制。

内源性和外源性内标除了来源不同外,在实际监测作用上也有差异。

内源性内标来自人细胞,可监测样本的采集和储运过程。用于新冠检测的拭子样本,在采集时难以通过肉眼判断样品是否采集到位,因此待检样本中的人基因含量,在一定程度上可用于确认是否采集到了人源性样品。不过,人基因组与病原体靶标在提取效率上有所差异,内源性内标并不能很好地评测病原体的提取过程。另外,新冠样品若采用混样检测,也无法完全发挥内源性内标监测采样的作用。

外源性内标则需在样本处理前加入,再参与核酸提取检测,相比内源性内标多了一步操作,这就可能增加因操作失误导致的复检概率增多,同时人工加入的样品也无法监测样本采集和储运过程。但外源性内标作为人工添加的样品,总体性能更加可控。采用与病毒结构相似的假病毒或其它无感染性的病毒作为内标,能更好的反映核酸提取过程;确切的内标添加量,甚至可监测样本提取效率或PCR扩增差异。另外,外源性内标也适用于环境样本的检测。

那么,内源性内标和外源性内标应该选择哪种呢?如果从内标的监测功能来看,在样本处理和核酸检测过程中,两者均能满足防止假阴性出现的要求。选择什么样的内标,还需根据产品设计以及检测需求进行确定。

但换一个角度,当两个选择各有优劣时,是否必须二选其一?或许,也可两者皆选。以单人份独立包装的检测试剂为例,当检测过程中出现靶标和内标均无信号的结果时,如果单单只有内源性或外源性内标的产品,便无法确认该异常结果是样本问题还是试剂失效造成的,也就难以确定后续复检形式:是重新加样复测呢?还是需重新采样复检呢?而含有内外源的双内标检测系统,则可为检测结果无效的原因缩小排查范围。

内源和外源,是二选其一,还是二者兼得,需根据具体的产品形式和使用场景进行确定,有些选择并非必分优劣,或许更多的选择,应该是给产品开发者更多的思考,进一步完善产品开发思路。

4.常规试剂与快检试剂

荧光PCR的检测时间相对较长,在大筛查需求得到满足的时候,市场便开始注重解放人力、提高时效性,此时便携式、一体化、快速检测的需求便应运而生。为达到新冠的快速检测,新设备、新方法、新技术轮番登台表演,老技术搭配新仪器、新技术结合新思路,使得检测时间一再缩短,为疫情防控发挥了重要作用。

免提取的快速检测试剂、流水线操作的一体化设备、样本进结果出的分子POCT,展现了行业多方向发展方式。尽管某些产品只是特定环境下产生的,但能找准应用场景的,同样是一款好产品。

那快检产品会是一款好产品吗?

当前,由于技术限制,有些快检产品尚未达到理想状态。若能在确保性能及适用范围的条件下,尽量加快检测时间,固然最好。但同时是否也应该看看,那些对时间要求不高的应用场景,其检测时间的可接受限度会在哪里呢?
只有实地调查,切实体验使用者的实际操作,才能明确应用场景。

在新冠大规模筛查时,通量无法满足需求、准确性难以保证的产品,即使检测时间再短,也不会是市场所追求的。

新冠疫情之下,催生的“核酸快检”概念,也应有其相对的使用场景,没有明确方向,而只因概念而生的产品,不会走得太远。

5.单品销售与整体解决方案

新冠期间,产品的销售形式也在发生变化,由单品销售向整体解决方案转移。这也就促使企业搭建了从样本处理到结果报告的全套检测流程,不管是搭配半自动或全自动设备使用,还是直接采用一体化检测设备,均是为了更好地满足市场需求。甚至于,与流水线检测系统或移动方舱实验室的结合,更为产品形式提出了新要求。

事实上,整体的解决方案也更能保障产品性能,这种倾向,在产品注册要求中也越来越明确。从样本采集直至结果报告,均经过企业验证测试的流程,才是可靠的检测系统。

而基于新冠建立的整体解决方案,也将为后续其它产品开发提供更多的参考价值。相信,那些借此机会打入核酸分子检测领域的厂家,其新冠产品终将只是个着力点,未来,不管是以合作或收购形式,抑或自研自产,企业必进一步拓展产品线,提供全方位、多方向的解决方案。也许,只有这样,才不至于受限。

6.写在最后

核酸分子检测产品的上市之路并不容易,从立项开发到产品注册,每一步都得经受考验,即使产品成功获得上市准入,不被市场认可的也同样会黯然消失。

一款好的产品,其定位应源自客户诉求,应用价值应能满足市场核心需求。脱离实际需求开发的产品,终究会因找不到应用场景而被舍弃。所以,项目规划相当重要,或许它就会成为企业前进的关键一步。

回望新冠爆发初期,项目成立之时,对体外诊断企业来说,是风险还是机遇,时至今日,或已定性。只是,当新冠退去,未来的产品开发之路又该如何走,当再一次立项时,会变得谨小慎微还是大胆激进?
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