新冠疫情爆发至今，已近两年，回看那些梭哈新冠检测试剂的企业，有的混得风生水起，有的活得并不如意。能以此为机遇的企业，或以黑马之势奔向行业前列，或以东山再起之态笑傲江湖。期间，新冠核酸分子检测产品，从靶标设计到灵敏度要求，从检测时长再到收费标准，无不影响着企业发展的方向。
1.单靶标与多靶标
病原体靶标的选择需具有特异性，即检测区域需为高度保守的核酸序列，为病原体所独有。一般情况下，选择病原体的单个特异性基因序列作为靶标，设计对应的引物探针即可。
而在国内获批的新冠核酸检测产品中，均是基于其开放读码框1a/b(open reading frame 1ab,ORF1ab)、包膜蛋白(Envelope protein, E)和核壳蛋白(Nucleocapsid protein, N)选择检测靶标的，其组合主要有单靶标(ORF1ab或N)、双靶标(ORF1ab和N)以及三靶标(ORF1ab、N和E)，其中以双靶标检测产品最多。
实际上，在新冠病毒序列公布后，国家卫健委印发的《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南》里，即推荐了选用ORF1ab和N基因两个区域进行检测。再到后来，《新冠病毒样本采样和检测技术指南》里，又对单靶标阳性的检测结果提出了“重新采样、重新检测”的要求。从中，或许可以看出推荐双靶标检测的原因，一是为了防止漏检、二是为了提高准确性。另外，新冠作为一种RNA病毒，在复制过程中产生变异的几率相对较大，期间时不时出现的变异株也确实证明了这一点。当变异位点出现在引物或探针设计的位置时，则可能造成产品性能下降，导致检测结果出现假阴性。而双靶标设计的产品，则兼顾两个不同基因，其中一个基因漏检，还有另一个基因确保检测结果的准确性。此外，ORF1ab基因特异性优于N基因，而N基因的检出率高于ORF1ab基因，该两个基因特性的互补，在结果检测上具有双重保障，这也便体现出了多靶标检测的优势。
那么，检测一个病原体时，其靶标设置是否越多越好呢？
答案显然不是。目前新冠核酸检测产品中，在多靶标检测方法上，绝大多数采用了单管多重检测。在单管反应体系中，引物探针越多，其相互干扰的可能性就越大。这样，本想着增加靶标检测位点以提高检出率，最后结果可能会适得其反。而且，单个病原体采用多靶标检测时，其判读方法会更加复杂，复检的概率也会增多，最后可能在检测性能和使用体验上难以两全其美。而单靶标检测产品，只要选择的靶标特异性和灵敏度合适，也同样可满足需求。单靶标反应体系中，其靶标可控性也更强，受其它靶标的干扰较少，测试优化时间相对较短，而且理论上，单靶标的检测灵敏度也将更高。
但不管怎样，经此一役，多重检测必成分子诊断企业的基础技术储备，也终将成为分子检测产品的高级配置。因为，不管是对单个病原体的多靶点检测，还是对不同病原体的多重检测，单管多重的检测方法均是值得深入探索的。
2.高灵敏与防污染
新冠产品在早期开发阶段，市场对灵敏度的要求并未有明确规定，而企业也就更多地将最低检出限保守地确定为1000 copies/mL，其原因一方面是还未有标准品进行定标确认，另一方面也还不清楚市场的实际需求。最后，随着测试验证数据的增加，也在市场需求的驱动下，高灵敏核酸检测试剂越来越被关注，检测限≤500拷贝/mL也就成了企业产品灵敏度的一个要求。目前国内获批的新冠核酸分子检测产品中，检测限最低为100 copies/mL(华大单靶标)，大部分产品最低检出限为200~500 copies/mL。
从检测原理看，当荧光PCR的检测极限为一个确定数值时，为了提高检测灵敏度，最直接的方法就是增加反应体系中的靶标数量。
例如，对于一个浓度为500 copies/mL的样本，取200μL进行核酸提取，并加入100μL洗脱收集核酸，最后取10μL核酸洗脱液加入反应体系中，通过计算可知道反应体系中的模板量理论为10copies。
基于此操作过程，在反应体系检测能力固定的条件下，若想进一步提高灵敏度，则可对样本前处理和操作流程进行优化。不管是增加样本上样量，还是减少洗脱体积，抑或提高洗脱产物加入量，这些单一方面的改进，皆可直接提升反应体系中的靶标数量，从而提高体系对样本的检测灵敏度。而这些改进方法，在提供整体解决方案或一体化检测系统的厂家中，其实现的方式将更加容易，兴许正因如此，新冠也顺便带火了整体解决方案和一体机。
然而，高灵敏的试剂，在操作不当时，也更易因污染造成的假阳性而困扰。在国内“动态清零”的大背景下，一有散发疫情，便是全员核酸检测，如此大规模的核酸筛查工程，高灵敏试剂对疫情防控的意义不言而喻，但一旦出现污染，其后果也是不堪设想。
虽然在国内对分子检测实验室明确要求分区设置，以确保生物安全性和检验质量，但作为产品的设计者，企业在产品开发时，就应从使用者角度出发，降低潜在的产品使用风险。例如，在反应体系中加入UNG酶，以降低扩增产物污染造成的假阳性；又或者，采用半自动或全自动仪器进行检测时，利用合理有效的设计，以防止污染产生。
实际上，在分子诊断行业，总不乏更高灵敏度的检测方法推出，但其实际应用价值还需进一步考察。其中，灵敏度、特异性和防污染能力的相互协调，便是关键因素之一。
3.内源性内标与外源性内标
核酸分子检测体系中，除了靶标之外，还有用于监测反应体系的内标。内标有内、外源之分，内源性内标常为人源性管家基因，可伴随样本的采集而进入检测体系；外源性内标则是人工添加的样品，可为人工合成的基因片段、无感染性的假病毒或病毒颗粒。
在《2019新冠病毒核酸检测试剂注册技术审评要点》中，即已要求内标应与靶核酸一同提取及扩增，因此无论是内源性内标，还是外源性内标，两者均需参与提取检测，以对提取或扩增异常导致的假阴性结果进行质量控制。
内源性和外源性内标除了来源不同外，在实际监测作用上也有差异。
内源性内标来自人细胞，可监测样本的采集和储运过程。用于新冠检测的拭子样本，在采集时难以通过肉眼判断样品是否采集到位，因此待检样本中的人基因含量，在一定程度上可用于确认是否采集到了人源性样品。不过，人基因组与病原体靶标在提取效率上有所差异，内源性内标并不能很好地评测病原体的提取过程。另外，新冠样品若采用混样检测，也无法完全发挥内源性内标监测采样的作用。
外源性内标则需在样本处理前加入，再参与核酸提取检测，相比内源性内标多了一步操作，这就可能增加因操作失误导致的复检概率增多，同时人工加入的样品也无法监测样本采集和储运过程。但外源性内标作为人工添加的样品，总体性能更加可控。采用与病毒结构相似的假病毒或其它无感染性的病毒作为内标，能更好的反映核酸提取过程；确切的内标添加量，甚至可监测样本提取效率或PCR扩增差异。另外，外源性内标也适用于环境样本的检测。
那么，内源性内标和外源性内标应该选择哪种呢？如果从内标的监测功能来看，在样本处理和核酸检测过程中，两者均能满足防止假阴性出现的要求。选择什么样的内标，还需根据产品设计以及检测需求进行确定。
但换一个角度，当两个选择各有优劣时，是否必须二选其一？或许，也可两者皆选。以单人份独立包装的检测试剂为例，当检测过程中出现靶标和内标均无信号的结果时，如果单单只有内源性或外源性内标的产品，便无法确认该异常结果是样本问题还是试剂失效造成的，也就难以确定后续复检形式：是重新加样复测呢？还是需重新采样复检呢？而含有内外源的双内标检测系统，则可为检测结果无效的原因缩小排查范围。
内源和外源，是二选其一，还是二者兼得，需根据具体的产品形式和使用场景进行确定，有些选择并非必分优劣，或许更多的选择，应该是给产品开发者更多的思考，进一步完善产品开发思路。
4.常规试剂与快检试剂
荧光PCR的检测时间相对较长，在大筛查需求得到满足的时候，市场便开始注重解放人力、提高时效性，此时便携式、一体化、快速检测的需求便应运而生。为达到新冠的快速检测，新设备、新方法、新技术轮番登台表演，老技术搭配新仪器、新技术结合新思路，使得检测时间一再缩短，为疫情防控发挥了重要作用。
免提取的快速检测试剂、流水线操作的一体化设备、样本进结果出的分子POCT，展现了行业多方向发展方式。尽管某些产品只是特定环境下产生的，但能找准应用场景的，同样是一款好产品。
那快检产品会是一款好产品吗？
当前，由于技术限制，有些快检产品尚未达到理想状态。若能在确保性能及适用范围的条件下，尽量加快检测时间，固然最好。但同时是否也应该看看，那些对时间要求不高的应用场景，其检测时间的可接受限度会在哪里呢？ 只有实地调查，切实体验使用者的实际操作，才能明确应用场景。
在新冠大规模筛查时，通量无法满足需求、准确性难以保证的产品，即使检测时间再短，也不会是市场所追求的。
新冠疫情之下，催生的“核酸快检”概念，也应有其相对的使用场景，没有明确方向，而只因概念而生的产品，不会走得太远。
5.单品销售与整体解决方案
新冠期间，产品的销售形式也在发生变化，由单品销售向整体解决方案转移。这也就促使企业搭建了从样本处理到结果报告的全套检测流程，不管是搭配半自动或全自动设备使用，还是直接采用一体化检测设备，均是为了更好地满足市场需求。甚至于，与流水线检测系统或移动方舱实验室的结合，更为产品形式提出了新要求。
事实上，整体的解决方案也更能保障产品性能，这种倾向，在产品注册要求中也越来越明确。从样本采集直至结果报告，均经过企业验证测试的流程，才是可靠的检测系统。
而基于新冠建立的整体解决方案，也将为后续其它产品开发提供更多的参考价值。相信，那些借此机会打入核酸分子检测领域的厂家，其新冠产品终将只是个着力点，未来，不管是以合作或收购形式，抑或自研自产，企业必进一步拓展产品线，提供全方位、多方向的解决方案。也许，只有这样，才不至于受限。
6.写在最后
核酸分子检测产品的上市之路并不容易，从立项开发到产品注册，每一步都得经受考验，即使产品成功获得上市准入，不被市场认可的也同样会黯然消失。
一款好的产品，其定位应源自客户诉求，应用价值应能满足市场核心需求。脱离实际需求开发的产品，终究会因找不到应用场景而被舍弃。所以，项目规划相当重要，或许它就会成为企业前进的关键一步。
回望新冠爆发初期，项目成立之时，对体外诊断企业来说，是风险还是机遇，时至今日，或已定性。只是，当新冠退去，未来的产品开发之路又该如何走，当再一次立项时，会变得谨小慎微还是大胆激进？ ------------------------------------------------------------------------------
| 
|1号QQ群：140978441|2号QQ群：951835987|Archiver|手机版|IVD原料论坛-抗体世界旗下的论坛
发表于 2021-12-16 22:24:49
