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单采、混采、单检、混检如何选择?准确性竟差如此大

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发表于 2022-4-19 22:18:49 | 显示全部楼层 |阅读模式
笔者所在的实验室从2020年新冠疫情初期就开展了新冠核酸检测项目,亲历过疫情初期国内还没有及时生产配套的新冠病毒采集管、咽拭子以及试剂盒性能不稳定的艰苦阶段。

再到后期众多性能优越的试剂盒上市,配套取样的耗材及使用越来越规范,我们见证了这两年多来新冠核酸采集以及检测技术规范的不断更新和优化,也深刻理解了“单检”、“混检”、“单采”以及“混采”这些名称每一次推出其背后的工作所需以及现实意义。

我们在日常工作中经常会接到来自临床医生和民众的电话咨询,特别是混采收费低于单采收费后,好多民众就会问:混采的结果是不是不准确啊?混采结果是阴性还要不要再去做个单采等等问题。

今天我们就一并来解释一下“单检”、“混检”、“单采”和“混采”这些概念的区别以及对检测结果准确性的影响。


「概念」的区别

■ 单检

单检即“单个检测”,指样本采集时是将1个人的拭子单独放在1根病毒采集管中,这根采集管里通常含3mL病毒保存液(注:我们在实际工作中也会建议对疑似患者采样时同时采口咽拭子和鼻咽拭子,共2根拭子一起放入1根采集管中,以提高检出率)。

每个采集管单独作为一个独立的样本进行检测,比如检测试剂盒说明书中要求加原始样本200μl,那么这份单检样本就按200μl加入进行核酸提取。

  • 单检是疫情初期以及当前对重点人群检测、隔离监测以及新冠病毒感染者病程监测的主要检测方式。



■ 混检

混检即“混合检测”,样本采集完全同单检的方法,即1个人用1根病毒采集管(3mL病毒保存液),只是在核酸检测时为了提高检测效率和检测通量,把几个人的病毒采样管里的液体都减少加样量,几个人受检者占用1个检测通量进行后续的核酸提取和扩增。

比如,检测试剂盒说明书要求加原始样本200μl,采用5个人混检方案的话,那就是每个人加入原始样本量40μl(200μl/5人份=40μl/人份),其他检测步骤不变。

  • 混检主要是在2020年8月以前国家混采方案还未出台、混采管也未生产出来时,且为了提高新冠核酸筛查效率,用于人群大批量筛查时所使用的一个退而求其次的方案。在有混采的方案后,现在基本不用混检。



■单采

单采即“采集单个样本”,这个名称强调的是采集过程,是在混采方案推行后用于区别于混采的一种名称,其实质就是和单检是一样的,1个人占用1根采集管,核酸检测时也通常会单检,应用范围自然与单检的一样。


■混采

混采即“采集混合样本”,采集多个人的样本放在一起,以提高效率。混采又分为5合1混采、10合1混采以及20合1混采。

2020年8月17日,国务院联防联控机制医疗救治组(简称救治组)发布《关于印发新冠病毒核酸10合1混采检测技术规范的通知》[1];2022年1月15日救治组发布《关于印发新冠病毒核酸20合1混采检测技术规范的通知》[2]。这两份通知里都详细介绍了对病毒采集管和采样拭子的要求,对于10合1的采集管,要求内含6ml胍盐或其他有效病毒灭活剂的保存液;对于20合1的采集管,要求内含11-12ml胍盐或其他有效病毒灭活剂的保存液。

10合1是指将采集自10人的10支拭子集合于1个采集管中进行核酸检测的方法,20合1是指将采集自20人的20支拭子集合于1个采集管中进行核酸检测的方法。

  • 混采适用于全员或区域大规模新冠筛查,可明显提高检测效率、加快检测速度。




以上介绍了“单检”、“混检”、“单采”和“混采”这些概念的区别,下面针对“单检”、“混检”、“单采”和“混采”对核酸检测结果的影响逐一进行解析。


对「检测结果」的影响

因新冠核酸筛查所用的技术主要就是荧光PCR技术,所以今天只讨论不同的采集方案对荧光PCR检测结果的影响。

对于目前传播力(R0为9.5)如此强大的奥密克戎变异株,更需提高其敏感性,自然也就会牺牲其部分特异性。那怎样在尽可能不降低特异性的基础上又能提高其敏感性呢?当然是多次筛查!请先看下面分析:

据文献报道[3]:2020年在对广州市20348例密切接触者的调查发现,第1、2、3和第7轮核酸检测的敏感性与特异性分别为69.14%与99.99%、89.84%与99.99%、97.27%与99.99%、100%与99.98%。有相当一部分的感染者要经过多次筛查才能做出阳性,是PCR这个检测技术不好吗?我们来分析一下。

敏感性达不到最理想状态的100%,原因有很多,比如病程早期病毒载量低、样本收集的过早或过晚、未取到有效部位、没有正确的保存、运输和处理样本导致病毒RNA降解、口咽部食物或药物等含有PCR抑制物、病毒基因变异以及检测试剂盒灵敏度不高等因素。

在这儿先解释一下“灵敏度“这个术语,它和敏感性看上去很相似但实际上是完全不同的两个概念。灵敏度是指检测试剂或检测体系的最低分析浓度或最低检出限,比如甲公司生产的核酸检测试剂能检测到的最低病毒原始浓度是500拷贝数/mL,乙公司生产的试剂能检测到的最低病毒原始浓度是100拷贝数/mL,那么对于200拷贝数/mL这样一个病毒含量很低的样本,甲公司试剂做出来的结果是阴性(灵敏度不够,低浓度未能检出),乙公司试剂做出来则是阳性,因此试剂盒检测灵敏度是影响这个方法敏感度的重要因素。

除了试剂本身灵敏度对敏感性的影响以外,其他因素如取样不到位、病程早期病毒含量低、标本运输和保存不当,以及口咽部取材时含有未知的PCR抑制物等这些分析前因素也是影响整体敏感性下降的重要原因。

就拿PCR抑制物来说,咽拭子这类标本由于受口/鼻咽部分泌物以及进食、饮酒、吸烟等因素影响,会使样本的成分变得复杂。目前已证实乙醇(饮酒)、血红素(出血)、肝素(肝素抗凝管)、植物多糖(粪便或植物)、蛋白酶(牛奶)、胆酸盐(粪便)、钙离子(带有滑石粉的手套)等等成分可以抑制PCR扩增,还有很多未知的可以抑制PCR反应的物质,这些抑制物需要尽可能在取样时避免或者在提取核酸的过程中将其去除,否则会引起核酸扩增抑制,导致假阴性结果。

通过以上分析可知,要想提高新冠核酸检测的敏感性,不仅需要灵敏度高的检测试剂,还需要控制检验前的各种影响因素。在此基础上,通过多次筛查可明显提高监测敏感性。


对「敏感性」的影响

那接下来要说的就是单检、混检、单采、混采对敏感性的影响,其实就是这些不同的样本采集方式是否会对上述所提到的因素有影响。

■ 相对于单采、单检样本来讲,混检由于在加样时减少了单个样本的加样量,会使得样本的病毒检出率降低,但降低多少呢?

现在以10混检为例,假如10份样本中有1份是阳性样本,其余9份都是阴性样本,按照试剂盒说明书提取核酸时单检加样200μl,那么10混检的话,这份阳性样本在核酸提取时只加进去20μl,相当于病毒含量被稀释了10倍,这样出来的病毒扩增曲线会向右平移,平移多少个循环数呢?这里要做一个理想型的数学模式来推算。

1.png
图 以10倍的倍比稀释后的模板扩增曲线

理论上,一系列稀释的样品扩增曲线之间有均匀的间距。那么:

  • 5倍稀释的DNA样品,2n=5,n=Log2 (5)=2.32


  • 10倍稀释的DNA样品,2n=10,n=Log2 (10)=3.32


  • 20倍稀释的DNA样品,2n=20,n=Log2(20)=4.32



n为倍比稀释后的两条相邻曲线之间的Ct值差距。

Ct值
Ct值全称Cycle threshold,即循环阈值,其含义是指扩增到一定的循环数时,其扩增产物所携带的荧光值可以达到能被检测到的临界值水平,这时候所对应的循环数就是其Ct值。

所以稀释后的标本与原始标本相比,需要比原先更多的扩增循环数才能达到检测临界值,其Ct值是增加的,曲线会右移。

由此可见,以10混检、扩增程序设置总循环数是40为例,如果其中一个样本的病毒在单检时其Ct值大于36.68,那么在混检时其扩增曲线就会向右平移3.32个循环,也就是说混检后就检测不出来了,结果就是阴性。

那该如何避免混检所带来的弱阳性样本漏检的风险呢?

笔者建议可以通过加大扩增循环数,比如要做10混检的话,就在原先40个扩增的程序上再增加3-5个循环,这样就可避免Ct值为36左右的弱阳性样本漏检。

当然对于Ct值大于36.68的样本,这是属于非常弱的样本,但其对应的病毒载量究竟是多少?单纯这个定性实验无法得知,必须有新冠病毒核酸标准品制作标准曲线才能准确计算出来。

在这里需要指出的是:不仅是咽拭子,还有宫颈脱落细胞、溃疡面分泌物等这类标本,由于受取样时拭子擦拭力度和擦拭次数的影响,取样的初始量不容易标准化,不能像检测血液中乙肝病毒、丙肝病毒那样可以精准控制血清加样量,因此在进行分泌物标本的核酸检测项目时通常是做的定性试验,而不是绝对定量试验。

定性实验就不能过分依赖单次的分泌物样本的Ct值结果,需要第二次甚至更多次取样复核,两次取样的Ct值相差较大也是可能的。

此外,混检带来的另一个隐患是其中的一个或几个样本即使因采样不到位,因其内参基因会被其他样本的内参基因掩盖,而失去了内参基因监测样本取样是否合格的内质控作用。因此,对于疑似患者、发热门诊就诊患者、新冠患者的病程观察、密接者的筛查时,不建议用混检的方法。

■ 接下来要说一下混采对结果的影响了。

以10合1混采为例,前面已介绍过,10合1混采是10个人的拭子放在1个管子里,管子里的液体是6mL,相对于单采管的3mL来说,混采里某个样本的病毒浓度是被稀释了1倍。

我们仍以10个样本中有1个为阳性,其余9个样本都为阴性的例子来看,提取核酸时加的总液体量仍然是200μl,由于这个阳性患者的病毒浓度被稀释了1倍,因此最终的Ct值会延后1【计算公式n=Log2 (2)=1】。那假如这10个混采的人里面有2个人是阳性,那就和单采是一样的了,敏感性不会减弱;那如果大于2个人阳性,那就比单采的敏感性还高。

不管是5混采,10混采,还是20混采,都可以按以上这个理论推算出来。但要注意的是以上计算都是理论上和理想条件(核酸提取效率为100%,核酸扩增效率也是100%)下的计算方法,而实际工作中核酸提取效率和扩增效率不一定100%,所以按以上公式计算出来的Ct值差距和真实的是有出入的。

同样,混采带来的另一个隐患是其中的一个或几个样本即使因采样不到位,也不会被监测出来,道理同上面介绍的混检。

不管是混采还是混检,一旦做出阳性,灰区或单个靶标阳性,立即通知相关部门对该混采管的20个受试者暂时单独隔离,并重新采集单管拭子进行复核。

核酸单采、混采对结果的影响不能一概而论,而要根据具体情况来分析。

如果对于混采样本里仅有1个弱阳性的样本,可能会引起漏检,但要注意的是目前口碑良好的核酸检测试剂,其灵敏度可以达到200拷贝数/mL,甚至更低。其实,与其担心混采带来的敏感性下降而造成漏检风险还不如选择一款灵敏度高、性能稳定的试剂更为放心!

【参考文献】[1] 国务院应对新型冠状病毒肺炎疫情联防联控机制医疗救治组关于印发新冠病毒核酸10合1混采检测技术规范的通知(2020-08-07). http://www.nhc.gov.cn/yzygj/s765 ... 72edd6c65380e.shtml

[2] 国务院应对新型冠状病毒肺炎疫情联防联控机制医疗救治组关于印发新冠病毒核酸20合1混采检测技术规范的通知(2022-01-15). http://www.nhc.gov.cn/yzygj/s765 ... ca7c9e1f2f083.shtml


[3] 张文婷,刘丹,谢朝军,等. 广州市新型冠状病毒肺炎病例密切接触者核酸检测灵敏度和特异度分析. 中华流行病学杂志,2021, 42(8): 1347-1352
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