小科普：抗体偶联药物

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化学疗法是癌症标准的治疗方案。然而，那些对细胞有毒性的小分子药物对健康细胞以及肿瘤细胞的非特异性反应常常导致无法忍受的副作用。这些副作用损害了治疗的功效，并大大降低了癌症患者的生活质量。

抗体偶联药物（ADC）是一类新型的化学治疗药物，其包含单克隆抗体（mAb），该单克隆抗体可选择性结合与与细胞毒性小分子有效载荷相关的肿瘤相关抗原。使用可裂解的酶接头将有效小分子药物载荷附着于抗体。为了确定高度肿瘤特异性的mAb，具有最大功效的抗癌药物以及在循环中稳定但允许快速裂解以在ADC被细胞吸收后释放细胞杀伤性药物的连接物，科学家已经付出了很多努力。已经研究了30多个靶点，并且在临床开发的各个阶段，现在有20多个ADC药物，包括Trastuzumab-DM1（Roche），SGN-35（Seattle Genetics），HuN901-DM1（ImmunoGen），CR011-vcMMAE（Celidex Therapeutics） ），SAR3419（Sanofi-Aventis），CMC-544（Pfizer），和BIIB015（Biogen Idec）等等。

鉴于将药物有效载荷添加到已经很复杂的抗体中导致ADC的高度复杂性，ADC表征，制剂分析和生物学分析方法的开发和验证面临着巨大的挑战。Stephan等人发表了ADC的生物分析方法的综述。在当前的讨论中，从临床前的角度出发，注意力集中在ADC生物学分析检测方法的开发上。

药代动力学方法的评估ADC是一种异质混合物，包含具有不同药物有效载荷的单克隆抗体混合物。由于这种异质性，配体结合测定（LBA）通常用于ADC生物学分析。分析方法使用了多种平台，包括比色酶联免疫吸附测定，光测定和基于电化学发光的蛋白分析仪。总抗体测定法可用于定量测定结合或不结合药物的总抗体。靶向肿瘤抗原，抗独特型mAb，抗人免疫球蛋白（IgG）（Fab'），并且抗人IgG（Fc）抗体可用作捕获试剂。然后将抗人IgG（Fab'）使用辣根过氧化物酶（HRP）或抗人IgG（Fc）-HRP或具有链霉亲和素-HRP的生物素化抗人抗体用于检测（见下图1）。

图1：总抗体测定示意图

为了消除非特异性结合，猴吸附抗人IgG抗体通常用于非人灵长类动物研究。取决于接头的类型，药物结合的位置可位于（Fab'）或载体抗体的铰链区上。药物结合的化学计量可能会影响ADC捕获或检测试剂的结合，并显着影响测定性能。而且，即使结合位点没有被直接阻断，某些测定形式对药物负荷也很敏感。据报道，不同的测定形式会产生不同的药代动力学（PK），并显着影响关键PK参数的计算，例如清除率和药物暴露。似乎大多数测定形式对药物负荷非常敏感。

对于缀合的抗体LBA，将抗细胞毒性药物抗体用作捕捉剂或检测剂，并与上文概述的捕捉剂和检测剂配对，以测量缀合至少一种药物的抗体（参见下图2）。

图2：结合抗体测定示意图。

结合抗体测定法的优点在于它们能够量化循环中ADCs可能造成的药物逐步损失。但是，使用抗药物抗体进行检测时应格外小心，因为用于检测的ADC标准材料相比，ADC的体内载药量可能会发生变化。

ADC的成功设计是在循环中高药物连接物的稳定性与有效的肿瘤内细胞毒性药物释放的结合。过去几年中，在开发更稳定的连接方面取得了重大成就。但是，循环中从载体抗体中非特异性释放药物仍然是决定ADC半衰期的关键因素。为了测量已从载体抗体释放的药物部分（即游离药物），可以将竞争性LBA包被用于捕获的抗药抗体和恒定浓度的HRP-药物一起用作报告基因（参见下图3）。

图3：具有竞争性的药物LBA示意图。

因为从ADC释放的游离药物的清除速度比ADC自身的清除速度快得多，所以可能无法检测到游离药物。为了解决这个问题，可以测量与ADC结合的剩余药物。通过使用组织蛋白酶B消化释放先前与载体抗体结合的药物，然后通过竞争性LBA分析或LC-MS定量游离药物来实现此测量。

理想情况下，应在ADC开发和表征的早期阶段开发用于非临床PK生物学分析的测定方法。与平均DAR标准相比，可以通过测定富集或纯化的药物抗体比率（DAR）分数的回收率来进行分析评估，以确保不同的分析形式均等地回收药物。如果无法进行此分析，则对于生物分析方法的设计，ADC的作用机理，靶向的肿瘤抗原，接头的类型，药物抗体比率，细胞毒性药物等的详细信息是必需的。除了LBA方法外，亲水相互作用色谱（HILIC），HPLC和LC-MS还用于定量ADC。

ADC的免疫原性

尽管可以使用与确定一般治疗性抗体的免疫原性相同的方法来确定ADC的免疫原性，但仍需要针对靶向抗体，接头和药物成分的抗ADC抗体进行进一步表征，以解决阳性抗体的特异性。ADC结构的复杂性提出了在单克隆抗体治疗剂或小分子药物分析中以前没有遇到的其他问题。例如，针对接头或细胞毒性药物的抗体反应是否会影响ADC内在化？或者，仅中和针对靶向抗体互补决定区（CDR）的抗体会降低ADC的功效？

样品的选择

抗体通常被认为是稳定的。因此，大多数治疗性单克隆抗体的生物分析方法都建立在血清中。但是，这种全面的方法不适用于ADC的生物分析，在ADC中，小分子药物通过连接物与抗体的结合会产生一个分子，其整体稳定性取决于这三个成分中最不稳定的那个。为此，建议血浆是用于PK和免疫原性样品分析的优选基质，因为血浆中凝血级联的抑制作用比血清中的蛋白水解少得多。此外，可以在样品收集过程中添加蛋白酶抑制剂，以进一步稳定血浆中的ADC。

关键因素

LBA具有许多优势，包括无需进一步提取样品即可测量基质中的测试物的能力，高通量特性，宽动态范围和高灵敏度，一直是ADC生物分析所用的主要分析平台。，并要求最小的样品量。但是，关键试剂的可用性是开发高度特异性和灵敏LBA方法的关键组成部分。通常花费很多时间和精力来产生针对载体抗体或细胞毒性药物的抗独特型抗体。由于细胞毒性药物的免疫原性低，可能需要与血蓝蛋白（KLH）或佐剂结合才能产生抗体。对于大多数支持IND的研究，时间紧迫，因此需要在生物分析测定设计期间及早制定计划，这些决定因素会影响关键试剂的产生时间。这些关键试剂可以在内部制备，也可以分包给第三方，通常需要至少六个月的交货时间。抗体筛选，化验形式测试和试剂纯化是试剂生成过程的一部分，这些步骤将增加项目的时间，成本和风险。在某些情况下，抗载体抗体和靶向抗原可以商购获得。在这些情况下，至关重要的是要确保有足够数量的批次，这样试剂清单才能覆盖整个研究。与试剂供应商的沟通和建立良好关系很重要，应该成为关键考虑因素。如果在整个研究过程中使用了不同的试剂批次，则必须建立和实施评估和桥接不同试剂批次的适当方法。

结论

随着ADC技术变得越来越普遍，必须开发新的可靠方法来更好地表征体外和体内的不同ADC 。由于ADC的复杂性，许多LBA方法可用于相同的生物分析目的。因此，在分析开发和验证过程中必须谨慎行事，以确保所选方法最适合给定化合物。关键试剂是LBA的关键因素。因此，必须考虑足够的交付时间和精力来达到项目的目标。

参考文献：1. A. Wakankar, Y. Gokarn, and F. Jacobson, AAPS News Magazine, 13 (5), 14–21 (2010).2. J. P. Stephan, K. R. Kozak, and W. L. T. Wong, Bioanalysis 3 (6), 677–700 (2011).3. J. P. Stephan et al., Bioconjugate Chem. 19, 1673–1683 (2008).4. R. J. Sanderson et al., Clinical Cancer Res. 11, 843–852 (2005).

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