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聚合酶链式反应（PCR）是一种用于扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，被看作是生物体外的DNA复制，将微量的DNA片段进行大幅扩增，从而达到容易鉴定和识别的程度。对于PCR反应而言，“酶”起着至关重要的作用，并且每一种“酶”都具有不同的活性和功能。那么，都有哪些种类的酶呢？在IVD领域中又有哪些应用呢？ DND聚合酶 定义：它是以DNA为模板，从DNA5，端复制到3，端，催化底物dNTP分子聚合形成子代DNA的一类酶。 主要活性及作用：催化DNA合成。1、聚合作用。2、3，→5，外切酶活性—校对作用3、5，→3，外切酶活性—切除修复作用4、焦磷酸水解作用5、焦磷酸交换作用。
在IVD领域中常见的DNA 聚合酶包括：Taq热启动酶，在反应体系加热至70℃之前，采用化学修饰的方法封闭Taq酶的活性，进而抑制非特异性扩增。高保真DNA聚合酶，含有聚合中心和酶切中心，聚合中心具有5’-3’聚合酶活性，负责聚合作用；酶切中心具有3’-5’外切酶活性（也称校对活性），负责将不配对的核苷酸予以切除。
逆转录酶 定义：该酶以RNA为模板，按5'-3'方向合成一条与RNA模板互补的DNA单链的酶。 主要活性及作用：1、RNA指导的DNA聚合酶活性。2、RNase H活性3、以DNA指导的DNA聚合酶活性。 在IVD领域的应用：1、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）2、cDNA文库构建3、RNA测序4、RT-qPCR ，2019新冠核酸检测所配置的体系试剂当中，必然会加入逆转录酶。因为RNA病毒必须逆转录为DNA，才能进行PCR反应。
RNA聚合酶 定义：以一条DNA或RNA链为模板的聚合酶，因为在细胞内与DNA的遗传信息转录有关，也称为转录酶。 主要活性及作用：1、与DNA为模板；2、催化核苷酸通过聚合反应合成核酸；3、使核苷酸形成3，→5，—磷酸二酯键；4、按5'-3'方向按照碱基互补配对原则转录模板序列。
在IVD领域中常见的RNA聚合酶包括：T7 RNA聚合酶，专门催化5'→3'方向的RNA形成过程。目前体外诊断中，SAT技术就是应用T7 RNA聚合酶进行RNA扩增。该技术已经被广泛应用到病原体检测、血液病毒筛查、环境微生物检测等领域。
蛋白酶K 定义：蛋白酶K是一种从白色念珠菌分离出来的强力蛋白溶解酶，是DNA提取的关键试剂。 主要作用：使膜蛋白和DNA结合的蛋白质降解，促进DNA游离。在IVD领域中应用：用于质粒、基因组DNA、RNA的分离和抽提。在病毒核酸检测中，蛋白酶K可以裂解病毒的外壳蛋白并使其失活，同时将病毒基因组释放完成核酸抽提。
UDG酶 定义：别名是尿嘧啶-DNA糖基化酶也称为尿嘧啶 -N- 糖基化酶或UNG酶。是形成DNA、RNA单体以及编码遗传信息的化学结构。 作用：高效控制PCR残余污染。在IVD领域中应用：在临床检验的PCR试剂中含有UDG酶，以防止污染。
限制性核酸内切酶 定义：识别特定的核苷酸序列，并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。 作用：共分为3种类型：1型：同时具有修饰及识别切割的作用，其切割位距离识别序列很远。2型：只具有识别切割的作用，所切割位即识别序列。3型：同时具有修饰及识别切割的作用，切割位与识别序列较近。 在IVD领域中应用：1、基因定位和基因分离2、DNA分子碱基序列分析3、进行基因工程编辑。4、DNA物理图谱的组建
解旋酶 定义：利用ATP水解提供的能量来解开双链DNA核苷酸配对形成的氢键，从而形成单链DNA。 作用：在DNA或RNA复制过程中起到催化DNA或RNA解旋的作用。 在IVD领域中应用：等温扩增技术，利用热稳定解旋酶代替qPCR中的热变性过程，解开双链并延伸扩增。该技术不易产生非特异性扩增，同时也避免了PCR循环中升降温的过程，只需简单的设备即可检测。
修饰酶 定义：是能催化稀有碱基参入RNA或DNA，或对原有碱基进行修饰的酶，以防止限制性内切酶的破坏。 作用：将其他酶的结构进行共价修饰，使其在高活性形式和相对较低的活性形式之间互相转变。 在IVD领域中应用：5mC/m6A核酸修饰酶活性检测HTMR方法为靶向DNA/RNA甲基化的小分子调控剂的发现及活性评价提供强有力的证据。
无机焦磷酸酶 定义：简称焦磷酸酶，是一种催化一分子焦磷酸盐转化为两分子磷酸盐离子的酶。 作用：热稳定无机焦磷酸酶在100℃加热4h仍然具有100%活性，因此可用于PCR反应，解除生成的无机焦磷酸盐对PCR的抑制，增强DNA复制。
Taq Antibody 定义：是抗Taq DNA 聚合酶的抗体。 作用：PCR扩增时，高温变性前Taq Antibody与Taq 酶结合抑制DNA聚合酶活性，能够在低温条件下有效抑制引物的非特异性退火及引物二聚体引起的非特异性扩增。 在IVD领域中应用：高封闭效率Taq antibody可提高新冠病毒核酸检测试剂盒的检测灵敏度，助力新冠检测。 标准PCR过程分为三步：DNA变性、退火、延伸。在PCR开始升温到50℃10min或95℃2min即可发生灭活反应，UDG酶将反应体系中污染DNA产生的扩增消除。随后，模板DNA经过高温变性为单链DNA。在DNA聚合酶和适宜的温度下，两条引物分别和两条模板DNA链发生退火。又在DNA聚合酶下进行延伸。Taq Antibody与Taq 酶结合抑制DNA聚合酶活性，在低温条件下抑制非特异性扩增。在PCR反应中添加无机焦磷酸酶，焦磷酸水解为正磷酸，增加了反应的扩增效率。原料酶是分子检测行业的上游产业链。2020年，在巨大的核酸检测需求面前，市场对分子诊断试剂需求剧增，原料酶行业也因此得到快速发展。在生产方面，由于分子检测原料酶生产技术门槛较高，当前国内市场则主要依赖于进口。近年来，伴随着国内生产工艺的崛起，多家原材料企业上市，产品类别也逐渐丰富，但不可否认的是，国内IVD原材料行业仍处于发展初期，市场占比也较小，未来必然存在较大提升空间。------------------------------------------------------------------------------ | 
发表于 2022-9-20 21:21:31