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1.抗体的酶标记法 通过共价键经适当方法将酶联结在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，这些有色产物可用肉眼、光学显微镜和电子显微镜观查，也可以用分光光度计测定，呈色反应显示了酶的存在，从而证明发生了相应的免疫反应。
实验中使用偶联剂使酶与抗体结合，即通过应用单、双或多功能试剂，分别与大分子的抗体所存在的功能性基团发生反应，生成酶—抗体偶联复合物。不同的酶—抗体复合物制备方法中，最广泛应用的戊二醛法，本法与其它偶联方法相比，具有操作简单、反应条件温和，及实用面广等长处。
酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制备方法。高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。在制备方法上，宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。
1) 辣根过氧化物酶(HRP) 辣根过氧化物酶（HRP）标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG后该醛基与 IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。
操作步骤： 将5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中；加0.5ml 10mmol/L NaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时。 加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混匀。 加入0.75ml小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等（15mg/ml），混匀。 称取Sephadex G25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内；随后将上述交联物移入注射器外套；盖紧，室温作用（避光）3小时或4℃过夜。 (用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V体积新鲜配制的5mg/ml NaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟；再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时（或4℃过夜）。 将交联物过Sephadex G200或Sepharose 6B（2.6×50cm）层析纯化，分管收集。 酶结合物质量鉴定： 克分子比值测定 酶量（mg/ml）=OD403×0.4 IgG量（mg/ml）=（OD280-OD403×0.3）×0.62 克分子比值（E/P）=酶量×4/IgG量，一般在1-2之间。酶结合率=酶量×体积/抗体，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9；OD403/OD280等于0.4时，E/P约为1。 标记率=OD403/OD280 酶活性和抗体活性的测定可应用ELISA法、免疫扩散、DAB-H2O2显色反应测定酶结合物的酶活性，抗体活性及效价、特异性。 HRP抗体结合物的保存：加入等量甘油后，小量分装-20℃存放，防止反复冻融；或加入等量60%甘油4℃保存；不宜加NaN3或酚防腐，否则会影响酶活性。必要时冻干保存，以BSA或脱脂牛奶作保护剂。
2) 碱性磷酸酶（AKP） 碱性磷酸酶（AKP）用于标记抗体，常用戊二醛一步法，将酶和单抗混合，再加入适量戊二醛，使酶和抗体蛋白的NH2分别与两个醛基结合，制备成结合物。该法简便，但所得产物不均一，抗体活性损失大，酶标记率低。 操作步骤： 将5mg AKP加入1ml抗体溶液（2mg/ml）中溶解，装入透析袋，于4℃对0.01mol/L PH7.2 PBS透析18小时，换液三次。 加入2.5%戊二醛20ul，室温作用1-2小时，4℃对PBS透析过夜，其间换液三次。 换用0.05mol/L PH8.0 Tris-HCl缓冲液透析，4℃过夜，换液三次。 取出标记抗体，用含1%BSA的Tris-HCl缓冲液稀释至4ml，即为AKP标记物原液。 每毫升中加入0.4ml甘油，小量分装，保存备用。
2.抗体的生物素化标记 亲和素与生物素都可与蛋白质(包括抗原、抗体、酶等)、荧光素等分子结合而不影响后者的生物活性，是理想的标记剂。一个抗体分子可偶联数十个生物素或亲和素分子，而亲和素或生物素分子又可与酶或荧光素结合，从而组成一个生物放大系统，显著提高检测的灵敏度。常用的有亲和素–生物素标记法(Labeled avidin biotin，LAB)、亲和素-生物素桥法(bridged avidin biotin, BAB)和亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法(avidin biotin peroxid ase complex，ABC)。本实验可使抗体或其它蛋白质的ε-氨基通过手臂与酰化的生物素共价结合。其后，生物素化的分子可应用酶标-亲和素或荧光染料-链霉亲和素复合物来检测。
操作步骤： 将待生物素化的蛋白质用0.1 mol/L碳酸氢钠缓冲液（pH 8.0）或0.5 mol/L硼酸缓冲液（pH 8.6）稀释到1mg/ml,一般实验室应用的生物素化体积为1-2.5ml; 交互用0.1 mol/L碳酸氢钠缓冲液（pH 8.0）或0.5 mol/L硼酸缓冲液（pH 8.6），对蛋白质充分透析； 用1ml DMSO溶解生物素琥珀酰亚胺酯（NHSB）1mg； 向1ml蛋白质溶液（即含蛋白质1mg）加入120μl NHSB溶液（即含NHSB 120 μg）； 在室温下持续搅拌，保温2-4小时； 加入9.6μL1 mol/L NH4Cl (每25 μg NHSB 加1 μl)，在室温下搅拌10分钟； 在4℃，对PBS充分透析，以除去游离的生物素； 将样品上1ml的分子筛柱，以PBS缓慢洗脱，收集1ml/管，蛋白质在1-3ml之间洗下； 最后，样品加入叠氮钠（终浓度0.5g/L）及1.0g/L BSA。将结合产物置4℃，避光保存，亦可加入50%重蒸甘油，置―20℃保存。
实验要点及说明 如在反应混合液中有叠氮钠或游离氨基存在，会抑制标记反应。因此，蛋白质在反应前要对0.1 mol/L碳酸氢钠缓冲液或0.5 mol/L硼酸缓冲液充分透析； 所用的NHSB及待生物素化蛋白质之间的分子比按蛋白质表面的ε-氨基的密度会有所不同，选择不当则影响标记的效率，应先用几个不同的分子比来筛选最适条件； 用NHSB量过量也是不利的，抗原的结合位点可能因此被封闭，导致抗体失活； 由于抗体的氨基不易接近可能造成生物素化不足，此时可加入去污剂如Triton X-100,Tween 20等。 当游离ε-氨基（赖氨酸残基的氨基）存在于抗体的抗原结合位点时，或位于酶的催化位点时，生物素化会降低或损伤抗体蛋白的结合力或活性。此时，应试用其它交联方法； 生物素还可能与不同的功能基团，如羰基、氨基、巯基、异咪唑基及苯酚基，也可与糖基共价结合； 交联反应后，应充分透析，否则，残余的生物素会对生物素化抗体与亲和素的结合产生竞争作用； 在细胞的荧光标记实验中，中和亲和素的本底低，但由于链霉亲和素含有少量正电荷，故对某些细胞可导致高本底。
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发表于 2023-3-18 21:49:22