来源：卡尤迪生物
近年来，面对精准诊疗对检测速度、便捷性等要求的不断提升，传统PCR平台出现了其技术上的困局，推动着该技术“由繁至简”的发展需求，由此，在传统分子诊断标准化流程基础上，分子POCT应运而生。
标准化实验室内常规核酸检测过程主要包括3个步骤：试剂配制、样品处理（核酸提取与纯化）、核酸扩增和检测。需专业的实验操作人员及物理分区空间，各环节步骤均需人工参与，各环节实验操作步骤需严格按照《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》要求执行，以降低样品和试剂对操作人员造成生物安全危害以及核酸产物污染的风险。
面对复杂的标准化常规核酸检测流程，分子POCT通过不断技术创新与优化，通过全自动、一体化设计建立符合即时检验(POCT)要求的分子生物学检测系统，该系统是整合一体化封闭系统，其试剂配制、核酸提取、扩增检测均在同一封闭、便携式仪器上完成。
该系统是上述难题的重要解决方案，通过实现“样品进－结果出”的检测目标，突破了传统PCR检测中时间、空间、人力三个维度的限制。
技术优势：
No.1 便携式分子POCT检测系统 所涉及的生物技术
目前各公司已相继推出诸多分子POCT检测平台产品，但各平台不仅采用的技术方案存在差异，在适用范围上也有很大差别。依据应用场景, 分子POCT检测分析系统主要分为两大类，第一类是大通量检测系统：主要面向大型医院等医学检验机构使用的全自动核酸检测工作站及配套试剂，一般比较大，检测通量高，有一定的空间要求；第二类是小通量检测系统：主要是可实现现场“即时诊断”的便携式分子POCT检测分析设备及配套试剂。
便携式分子POCT检测系统优势在于：无需将样品带回中心实验室，实现现场检测，使用方便快捷；全封闭的自动化处理过程，减少人为干预，操作简便，省时省力，保护操作人员自身安全，对环境的污染小。
便携式分子POCT检测系统的研发并非易事，其研制与搭建是一个复杂的系统工程，需要医学、生物、化学、工程、物理等多学科知识交叉，就系统而言主要涉及核酸检测生物技术和检测系统器件技术两个方面，同时各自又有若干可供选择的技术方案，通过排列组合能够形成多种技术路径。
图 | 便携式分子POCT检测分析系统技术路线
上图体现了便携式分子POCT检测系统多学科交叉化和技术路径多样化的技术特点。目前市场上几乎大部分商业化的分子POCT检测系统都是基于微流控芯片（卡盒）平台技术实现的，但也有小部分产品采用的是非微流控的技术。对于研发分子POCT检测系统用微流控技术平台相对而言比非微流控技术平台要容易，且可学习的商业化案例也多些。
无论以何种技术平台去开发产品，其研发思路和技术原理是相通的，最终都要将传统的PCR分区、防控污染、生物安全性等问题解决，也即是将标准化的实验流程进行功能集合，如样本信息录入、试剂制备、核酸提取、核酸检测与分析等，进行全流程的自动化、智能化整合。只是微流控技术和分子检测的应用场景比较契合，更容易实现以上的技术发展需求。
No.2 便携式分子POCT微流控卡盒 所涉及的生物技术
标准化的分子检测通常需要试剂制备、样品处理（样品裂解、核酸提取与纯化）、检测与分析（核酸扩增和扩增产物分析）这几个步骤。当面对具体的核酸检测需求时，对样品裂解、核酸提取和扩增检测方法的合理选择与组合，需要统筹考虑众多因素，如样品类型、样品体积、待分析核酸的来源（人的细胞、细菌、病毒等）、脱氧核糖核酸DNA或是核糖核酸RNA分析、检测灵敏度、检测靶标数目等。
没有一种单一固定的方法可以适用所有类型样品的核酸检测。下面将分别针对核酸检测的每步操作介绍现有的技术方法。
1► 样品裂解
样品裂解是核酸分析的第一步，破坏包裹在核酸外的细胞膜或细胞壁，保证了在细胞、细菌或病毒内的核酸释放。
释放核酸的方法主要包括化学裂解、机械裂解和热裂解等方式。化学裂解和酶裂解通常是比较温和的方法，通常会很少使DNA断裂。机械裂解可以更均一地裂解细胞，同化学裂解相比，机械处理具有更高的裂解效率和更低的选择性。机械处理可以更剧烈和全面地裂解细胞，但会造成DNA的断裂。
2► 核酸提取纯化
核酸的提取与纯化是为了保证样品中的核酸完整性与纯度，使后续的核酸扩增反应可以顺利进行。核酸提取方法大致可分为液相提取与固相提取。核酸纯化方法是影响提取核酸质量高低的最重要因素，也是下游分子生物学试验成败的关键。目前常见的核酸纯化方法有酚-氯仿抽提/醇沉淀方法、高盐沉淀蛋白质/醇沉淀方法、离心柱法和生物磁珠法。
其中基于磁珠法的核酸提取是目前最常用的核酸提取方法，在磁珠表面修饰可以吸附核酸的特定官能团，通过不同的溶液环境以及外界磁场作用，达到裂解、结合、洗涤和洗脱的目的。该方法容易实现自动化、高通量的操作。
主要优势有： 提取灵敏度高 纯化纯度高 提取产量高 分离快速 自动化操作 高通量提取 无毒无害无污染
3► 核酸扩增
待检测样品中的核酸物质含量通常较低，核酸扩增可以显著提高核酸目的片段的浓度，从而提供现有检测设备可检出的产物信号。核酸扩增技术根据工作温度的不同可分为变温扩增、等温扩增。
01 变温扩增
变温扩增技术主要是指聚合酶链式反应PCR，其在分子生物学中应用最为广泛，是核酸检测最常用的方法。PCR主要利用３个温度对核酸分子进行变性（95℃）、退火（55℃～65℃）和延伸（72℃）。在变性阶段，双链DNA分子变成单链；在退火阶段，引物与单链DNA的互补序列结合形成双链；在延伸阶段，DNA聚合酶催化形成新的DNA双链，周而复始，重复循环，即可得到指数扩增的核酸。根据循环次数、仪器的升降温速率性能，PCR反应一般耗时１至数小时。
随着科技的发展与创新，目前已经有一些分子POCT的产品通过合成生物学的方法突破聚合酶的技术瓶颈，可实现30min内完成45循环的极速扩增，并保证其灵敏性和特异性不差于常规检测方法，甚至有些产品还超越了常规检测方法的灵敏性和特异性。虽POCT设备相对较小、便携，但仪器设备的荧光通道数量与常规大型仪器无差异，面对临床多重病原体检测的需求，具有较好的应用前景。由于其对温度循环的依赖，配套控制仪器成本相对较高。
02 恒温扩增
恒温扩增技术利用生物体的DNA或RNA合成酶，无需温度循环即可实现核酸的扩增，如环介导等温扩增LAMP、重组酶聚合酶扩增RPA、滚环扩增RCA、解旋酶依赖扩增HDA、核酸序列依赖扩增ＮASBA等。
恒温扩增技术的出现，降低了核酸扩增对精确温控设备的需求，使得便携式核酸检测设备的成本相对较低，部分手持式分子POCT检测设备产品也有问世。但对于临床上多重靶标的检测需求而言，由于恒温扩增技术本身的短板，该检测技术就显得有些力不从心。
4► 扩增产物检测
在核酸扩增过程中或完成扩增后，检测扩增产物的量是获取靶标核酸信息的重要步骤。常见的核酸信号检测技术有光学检测、电化学检测、电子检测。可以根据实验或诊断的需求选择合适的产物分析技术，从而完成核酸检测。
光学检测核酸通常通过检测结合在靶标核酸上的光学探针来实现，典型的光信号包括吸光度、荧光信号、光反射和等离子体共振。操作人员可以使用肉眼、荧光检测仪、酶标仪、显微镜或智能手机等，在离心管、孔板、试纸条、微流控芯片等平台上检测这些光信号。其中荧光信号检测是最为常用的核酸检测方法，荧光探针可以和双链核酸非特异性结合或是和对应的核酸单链互补结合进而产生荧光信号。使用荧光基团与淬灭基团结合的探针能够保证更高的特异性与灵敏度。
电化学检测也是常用的核酸检测方法，其能够在微纳尺度的平台上实现核酸非标记、高灵敏和高特异性的检测。典型的电化学核酸传感器包含３个接触电极，分别是表面修饰了捕获核酸探针的工作电极WE、对电极CE和参考电极RE。通过检测３个电极之间电流、电势和阻抗的变化，来判断是否有靶标核酸。
电子检测核酸是利用半导体材料与生物大分子结合具有灵敏的响应特性，通常以场效应晶体管FETs形式实现检测。与电化学传感器类似，在检测核酸的场效应管设计中，负责捕获的核酸探针固定在FET表面，当靶标核酸与固定的探针杂交结合后，就会产生电流或电压信号的变化。硅纳米线、碳纳米管、石墨烯等常被用来制作电子传感器，其检测灵敏度非常高，甚至可以实现无需扩增的靶标核酸检测。
No.3 微流控卡盒之试剂存储技术
便携式全集成核酸分析系统需要微型化、集成化与自动化地实现不同需求的核酸检测全流程，因此又具有高度集成化与功能拓展化的技术特点。该系统的构建主要涉及反应试剂存储技术、微流控技术和光机电软件一体化仪器技术。其中，前两项为便携式全集成核酸检测的关键核心技术。
传统的微流控芯片需要通过外接的泵阀和复杂的宏观与微观的微流道接口，将外界的反应液体注入芯片进行反应，该过程需要多步人工操作，难以将反应液体集成到芯片上，实现反应液在芯片上的可控存储与释放。这一方面是受限于芯片设计与加工工艺，另一方面是试剂长期保存本身就有难度。因而，传统的微流控芯片系统只能适应实验室的研究，难以适用于现场的即时诊断。
随着在芯片上试剂存储技术的不断发展成熟，便携式的全集成核酸分析系统也逐渐从实验室走向了应用现场。应用于核酸检测分析的试剂类型有多种类型，如反应酶、引物、底物和缓冲溶液等，不同的试剂类型需要根据自身性质选择不同的存储条件。便携式全集成核酸分析系统理论上需要稳定储存所有反应所需的液态和固态试剂，并可实现试剂的可控释放与反应，进而方便用户操作，实现“样品进－结果出”的目标。
1► 液体试剂存储
液体试剂存储按其存储位置可分为在芯片内部和外部两大类。 第一类是存储在微流控芯片之外的液体试剂，芯片通过细导管或是储液管接口与外界储液管相连，使用时通过外部控制设备将试剂注入或导入芯片进行反应。这种方法的缺点是需要外界的导管、泵阀、流路、控制单元，增加了泄漏、污染、产生气泡的风险，以及无法避免管道接口中的死体积。 第二类是存储在微流控芯片之内，通过主动控制释放的方法，使试剂进入芯片反应腔参与反应。具体分为：使用铝箔、塑料或玻璃的泡罩密封存储试剂，使用时通过挤压、刺破等施加外力方式破坏密封释放试剂；使用石蜡、水凝胶、可被电热溶解的薄膜或是单面胶密封芯片上的储液腔出口，使用时局部加热融化石蜡、或加热使水凝胶脱水、或通电融化薄膜、或顶开单面胶密封阀，最终释放被存储的液体。
2► 固体试剂存储
固体试剂存储方法按固定位置也分为两类。第一类是先将试剂固定在载体上，之后将载体集成到微流控芯片之内；第二类是直接在微流控芯片内固定试剂。
第一类方法最常用的载体是微珠。微珠的材料有多种选择，如：多聚物、玻璃、金属、凝胶等，其尺寸结构可以从纳米级别跨度到毫米水平。微珠材料既可以通过被动吸附方式固定试剂，也能够通过化学反应交联试剂。微珠比表面积大，与平整芯片表面比，能够有效固定更多试剂，反应效率也更高。此外，将试剂固定在微珠上，能够将试剂的固定与试剂在芯片上存储集成这两步操作分步优化，因此简化了质控，使得芯片装配与应用更加灵活。
第二类方法是在芯片内直接固定试剂。固定方式分为两种：一种是将试剂通过冻干、真空干燥或多孔介质吸附干燥等方式进行脱水处理，在反应腔内加入固体形态的试剂。使用时，用缓冲液复溶后进行后续的反应。另一种是利用非接触式喷样、接触式点样、微接触式印刷、浸蘸笔纳米加工等方式图案化固定反应试剂于微流控芯片内的反应基底上，如玻璃、硅片、电极等。使用时，待检测分子与图案化固定的试剂进行结合反应，产生光学、电学、化学等信号。
*参考：微流控学习公众号文章：《便携式全集成核酸检测（分子POCT）的系统性学习》 | 
发表于 2023-7-4 16:42:17