来源：中国衰老标志物研究联合体、CACLP体外诊断资讯
2023年7月，中国衰老标志物研究联合体（Aging Biomarker Consortium，ABC）发布《血管衰老标志物专家共识（2023）》，该共识对与血管衰老相关的生物标志物进行了全面评估，并提出了一个系统框架，将生物标志物分为三个维度：功能特征、结构特征和体液标志物。近日，该专家共识以“A framework of biomarkers for vascular aging: A consensus statement by the Aging Biomarker Consortium”为题发表于Life Medicine。
全文链接： https://doi.org/10.1093/lifemedi/lnad033
第三部分体液标志物内容如下： 体液标记物因其取材方便并且操作无创（尿液）或微创（血液）的特点，非常适合作为辅助临床评估血管衰老的有用工具。在衰老人群中，开发早期的体液标志物有助于识别血管损伤高风险个体，从而预防衰老相关心脑血管疾病并减少社会经济负担。临床上通常是抽取静脉血，静脉血中所含成分是经血液和各组织之间物质交换后的产物，包括各组织器官的分泌产物和代谢产物，并不能完全反映血液为各组织器官所提供的各种营养物质情况以及血管组织自身的分泌和代谢情况。但是，血液中的成分可以直接作用于血管组织，特别是作用于血管内膜，影响血管组织的功能和结构。
因此，血液标志物的变化可以反映系统炎症、代谢和衰老水平的变化，并用于评估和预测血管衰老和相关疾病。
1 血浆炎症因子
血管衰老与炎症因子的分泌密切相关。衰老的血管细胞伴随着炎症相关分泌表型的增加（senescence-associated secretory phenotype，SASP）；同时，在衰老过程中，免疫系统会发生一系列变化，促进各种炎症因子的分泌，共同导致血液循环中多种炎症因子随着增龄而增加，促进血管衰老相关疾病的发生。血浆中的多种炎症因子，包括白介素（interleukin，IL）-6、IL-1、IL-1受体拮抗剂（IL-1Ra）、IL-8、γ干扰素（interferon γ，IFNγ）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNFα）、高敏C反应蛋白（high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP）以及血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）和活性氧化物（reactive oxygen species，ROS）等均与年龄正相关。
此外，研究发现红细胞分布宽度（red blood cell distribution width，RDW）的增加与全身炎症因子水平，包括hs-CRP、IL-6、TNF-α、金属基质蛋白酶2（matrix metallopeptidase 2，MMP-2）和MMP-9呈正相关性，RDW与这些炎症因子联合应用有助于更好地评估血管衰老以及主动脉病变。但因这些炎性标志物无特异性，受炎症性疾病和多种心脑血管影响大，更多是反映机体当前的炎症水平，不适宜单独作为血管衰老标志物。
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其它血浆蛋白
2.1 血浆胰岛素样生长因子1
胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor 1，IGF-1）广泛表达于多种细胞。作为一种内分泌和自分泌/旁分泌生长因子，IGF-1在循环系统中维持在较高的水平。研究发现，血浆IGF-1有益于改善血管衰老，其主要机制可能涉及减少氧化应激、细胞凋亡、促炎症信号传递以及内皮功能障碍。多项研究发现血浆IGF-1蛋白浓度随增龄而降低。在一项单中心横断面研究中，从年轻（28.37±4.2岁）到衰老（67.9±4.1岁）血浆IGF-1水平从175ng/mL降至约125ng/mL，血浆IGF-1水平随着年龄的增长而明显下降，并和增龄过程中伴随的脑血流的减少一起，共同推动了神经血管老化，损害脑血流并促进年龄有关的认知障碍。此外，老人血液中IGF-1的降低与老年人的高死亡率有成正相关，与cIMT呈负相关，提示血浆IGF-1浓度的减少可以是血管衰老标志物和心血管疾病的危险因素。
2.2 血浆成纤维细胞生长因子21
血液循环中的成纤维细胞生长因子21（fibroblast growth factor 21，FGF21）主要由肝脏表达和分泌。研究发现，血浆FGF21浓度与年龄呈正相关，并可被多种生活方式所调控。健康国人从20岁到70岁的空腹血浆FGF21浓度的中位值从113pg/mL增至210pg/mL，增龄是影响血浆FGF21浓度的独立影响因子，并且90%的60-70岁老年人的血浆FGF21浓度低于400pg/mL。高水平的血浆FGF21与心血管疾病风险增加密切相关，其机制可能是炎症及糖脂代谢异常导致的一种应激反应。据报道，血浆FGF21的临界值（范围为123.0至321.5pg/ml）是预测心血管风险的独立危险因素。
2.3 血浆腓骨蛋白-1
动脉硬化是心血管疾病的独立危险因素，而VSMC的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）重塑在这个过程中起到关键作用。血浆中，ECM蛋白的动态变化是可以被检测到的。腓骨蛋白-1（Fibulin-1）是一种重要的ECM蛋白，可以与弹性蛋白和微纤维相互作用，共同促进血管壁弹性纤维的稳定。研究发现，血浆Fibulin-1在高动脉硬化的人群中高表达，而且Fibulin-1的升高与baPWV增加呈正相关，在校正了年龄、血压等多种混杂因素后，高baPWV组（2376±147.7cm/s）和正常baPWV组（1171±147.7cm/s）之间平均血浆Fibulin-1的变化为12.69±0.89µg/mL vs. 9.84±0.71µg/mL（p<0.05），据此推测血浆Fibulin-1可以是一个可反映动脉僵硬度的标志物。
2.4 血浆古病毒HERVK包膜蛋白
最新的研究表明，休眠在人类基因组中的内源性逆转录病毒K（human endogenous retroviruse K，HERVK），随着组织细胞的衰老伴随的核周异染色质的减少和结构的松散化，其病毒基因可被解锁并被转录激活，在组织细胞中产生逆转录病毒样颗粒，促进多种细胞的衰老和组织的退化。老年人的血清中也可观察到HERVK包膜蛋白（HERVK-Env）的浓度较年轻人增加约2倍，提示HERVK的复活是细胞衰老和组织老化的一个标志和驱动力。
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血液循环中的细胞及囊泡
3.1 循环CD8+CD28- T淋巴细胞
无论是血管组织中，还是血液中，均存在着丰富的T淋巴细胞。T细胞，特别是CD8+细胞毒性T细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL细胞）表面的协同刺激分子CD28会随衰老发生丢失和耗竭，临床上表现为循环CD8+CD28- T细胞亚群随增龄显著增加。从出生到80岁，健康人血液中CD8+CD28- T细胞亚群占CD8+ T细胞的比例从0近乎线性地增长至60%左右，在临床上可以很便捷地通过流式细胞技术检出。相较于CD28+ T细胞，CD28- T细胞增殖能力降低，促炎细胞因子的表达和分泌增加，并在与衰老相关的多种心血管疾病中起着重要的作用。因此，检测血液中的CD8+CD28- T淋巴细胞也可能作为血管衰老的评估和心血管风险的预测。
3.2 循环内皮祖细胞
内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是来自于骨髓的内皮细胞前体，存在于外周血中。越来越多的证据表明，循环EPCs在维持血管内皮功能完整性方面发挥着重要作用，其具体作用机制可能是通过替代功能失调的内皮细胞进而促进损伤内皮的再生和修复。因此，循环EPCs的减少会导致血管内皮功能障碍，血管弹性受损。在健康男性中，循环EPCs与弗明汉危险评分呈显著负相关。事实上，随着年龄增长，循环EPCs的降低可能引起内皮功能障碍和动脉弹性受损。因此，EPCs的水平变化是累积性心血管风险的生物标志物。EPCs在血液中存在的数量较少，成熟的CD34+CD144+ EPCs在成年人外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中的比例约为0.06%，在老年人群中比例更低，较难与血液中的其它含量丰富的T细胞、B细胞和NK细胞通过流式细胞技术一起检出，在临床普及推广上存在一定的限制。
3.3 循环内皮微粒
按照大小、生成方式以及释放方式，细胞外囊泡分为外泌体、微粒体（microparticles，MPs）、凋亡体。血浆微粒体的异质性主要是由于他们来源于不同的细胞，包括红细胞、白细胞、血小板以及内皮细胞。这些MPs中含有丰富的活性蛋白、DNA、RNA、miRNA以及脂质。研究发现，体外培养的大多数细胞在复制性衰老（replicative senescence）和损伤诱导性衰老（damage-induced senescence）过程中，MPs的水平增加了10倍以上。
定义为直径在0.1-1.0μm之间的CD31+CD42-循环内皮微粒（endothelial microparticles，EMPs）被报道与baPWV有良好的正相关性（r=0.371, p=0.008），可以是内皮损伤和血管僵硬度增加的重要标志物。与年轻人相比，健康老年人（60±6岁）血浆中的CD31+CD41−、CD144+和CD62e+ EMPs的浓度相较于健康年轻人（26±3岁）有30%-50%的显著增加，其中部分EMPs与收缩压和PWV显著正相关，三种EMPs均和FMD显著负相关。此外，循环CD31+CD41−和CD144+ EMPs也被报道在不同程度上和高血压、高血脂和代谢综合征相关。因此，EMPs可被认为是增龄相关的血管损伤和代谢紊乱的标志物。由于EMPs直径较小，检测需要一定的技术水平，并且不同研究团队通过不同表面标记物定义的EMPs种类较多，需基于统一的表面标记物的EMP定义，临床上普及推广尚存在一定的限制。
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其它功能性标志物
4.1 DNA甲基化
衰老的血液中存在异常的DNA甲基化修饰。血液中低水平的DNA甲基化与AS进展和心血管风险增加有关。在AS患者中，单核细胞/巨噬细胞的基因特异性启动子DNA甲基化的异常变化可能成为一个有意义的应用于临床的诊断标志物。在742名老年男性血液中，长散布核元件-1（long interspersed element-1，LINE-1）的DNA甲基化水平明显下降，并与血液中高水平的血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）呈负相关。另外，在神经退行性疾病和老年性脑血管病患者的血浆标本中，全局甲基化和羟甲基化的水平都明显下降，而且DNA甲基转移酶3α（DNA methyltransferase 3 alpha，DNMT3α）的mRNA也显著减少。因此，血液中DNA甲基化整体水平的减少也可能作为血管衰老的标志物。
此外，DNA甲基化年龄（DNA methylation age，DNAmAge），也称“表观遗传时钟”（epigenetic clock），能紧密关联从新生到衰老的整个生物学过程，对整个生命过程中的任何组织进行比较准确的生物学年龄（biological age，BA）评估。不同的表观遗传时钟源自于不同的DNAmAge评估策略，不论是追踪了生命过程中来自人体多种组织和细胞353个基因组位点上的CpG甲基化变化的Horvath时钟（Horvath’s clock），还是仅评估单一血液中与年龄相关的71个CpG位点甲基化变化的Hannum时钟，以及纳入10个临床指标（实际年龄、白蛋白、肌酐、血糖、CRP等）及血液中513个CpG位点甲基化变化的预测表型年龄（phenotypic age）的Levine时钟，均能较好的反映整个生命周期中的血液年龄，进而影响及反映血管衰老的状况。目前这些甲基化时钟均是基于国外人群样本所得，是否适合国人生物学年龄的评估进而指征国人的血管衰老还有待验证。国人也需要建立基于国人样本的DNA甲基化时钟。
DNAmAge可以作为血管衰老的标志物，但由于DNAmAge评估的技术水平和成本较高，临床上较难推广。
4.2 循环免疫球蛋白G的糖基化
免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）可被糖基化修饰（N-glycosylation）进而调控其功能及系统炎症状态，并且大部分糖基化模式与衰老密切相关。血浆IgG的重链的天冬酰胺197（Asn197）位点上的糖基化模式通过超高效液相色谱（ultra performance liquid chromatography）分析可呈现24种糖基化模式的波峰（glycan peak 1-24，GP1-24）。对其中三种糖基化（GP6，GP14，GP15）水平的组合分析可解释58%的实际年龄和生物学年龄的变化。由于检测技术水平和成本较高，临床上较难推广。
4.3 血液外泌体非编码RNAs
非编码RNAs（ncRNAs），包括microRNAs（miRNAs）和长非编码RNAs（lncRNAs），在血管衰老过程中发挥着重要作用。血脂异常、高血糖和高血压都会导致血管细胞内miR-34a表达的异常升高，通过影响内皮细胞以及血管平滑肌细胞的功能，导致炎症和血管衰老。增龄以及多种增龄相关疾病患者血液中均检出miR-34a的浓度显著增加，提示血液中miR-34a的水平也可能作为衰老及血管衰老的标志物。外泌体miRNA也是潜在的血管衰老的生物学标志物。外泌体通过自分泌或者旁分泌的方式向邻近或者远处的细胞传递信号，从而参与细胞生理功能的调节。研究发现，血液中和血管组织中外泌体来源的miRNA通过调节血管内皮细胞、平滑肌细胞等的功能、ECM的重塑以及炎症因子的分泌，进而调控血管衰老。老年人血浆中外泌体miR-501-3p水平的升高与血管僵硬度相关。血浆中外泌体miR-34a浓度也被报道随增龄及增龄相关疾病而增加。miRNA及外泌体miRNA由于在体内半衰期较短，受各种疾病和环境因素影响较大，是否适宜单独作为血管衰老标志物在临床上普及应用还需要进一步验证。
4.4 循环代谢物
人体的代谢物涉及多种生理过程，包括各种无机或有机大分子及其衍生物，如氨基酸、核酸、碳水化合物、脂肪酸、功能性营养物质（如维生素和辅助因子），以及诸如性激素、药物中间体和毒素等化合物。人类代谢组数据库（human metabolome database，HMDB）已经注释了200000多种包括内源性（身体合成或产生）和外源性（来自环境）的代谢物。目前对代谢物进行定性定量分析的两种常用的技术手段为高效液相色谱联合质谱分析（high-performance liquid chromatography-triple quadruple mass spectrometry，LC-MS/MS）和核磁共振技术（nuclear magnetic resonance，NMR）。
血液中含有大量的内源性产生的或从环境吸收的代谢物，部分来自于高度可遗传的代谢物、或是受肠道微生物组、生活方式选择如吸烟或饮食的影响，更大部分代谢物的关键决定因素仍不为人所知。其中饮食和肠道微生物组对循环代谢物的决定作用和预测能力最为显著。部分重要的代谢物可对多种常见疾病的风险提供额外的预测信息，如心血管疾病、II型糖尿病和痴呆症等。
人的衰老伴随着多种生理和病理的改变，如脂质和脂蛋白、氨基酸、类固醇激素、肠道微生物组、饮食、炎症、氧化应激状态的变化以及肝肾功能的衰退等，均会带来血液和尿液中的代谢物组分和水平的变化。如多项研究显示衰老伴随着血液中色氨酸（tryptophan）水平的下降和酪氨酸（tyrosine）水平的增加；而在另外一项快速衰老的模型中观测到血浆中L-亮氨酸（L-methionine）水平的显著增加。衰老常伴随着血液中更高水平的胆固醇、多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）、磷脂胆碱（phosphatidyl choline）的代谢产物氧化三甲胺（trimethylamine N-oxide，TMAO）以及鞘脂类（sphingolipids）的神经酰胺（ceramide）等。这些分子都是心血管疾病的危险因素，也可能作为血管衰老的生物标志物。衰老也常伴随着血液中一些代谢物水平的降低，如谷氨酰胺/维生素B13的代谢产物尿苷（uridine）。尿苷不仅在老年群体血液中含量显著下降，尿苷本身也拥有包括提升干细胞活力、促进组织修复和再生、提高大脑认知及预防老年痴呆、改善睡眠等一系列预防和延缓衰老的功能。
4.5 尿液中的代谢物衰老过程与新陈代谢和氧化应激密切相关，尿液因为积累了身体的变化，也是发现生物标志物的一个非常好的来源。通过对衰老的大鼠和人的尿液的蛋白组学和代谢组学的分析显示，尿液中的随衰老变化的蛋白质和代谢产物多与肾脏的衰老相关。2012年通过LC-MS/MS技术分析猕猴血浆中和尿液中DNA和RNA的氧化产物水平表明，猕猴血液中和尿液中来自DNA的氧化产物8-氧化脱氧鸟苷（8-oxo-7,8-dihydrodeoxyguanosine，8-oxo-dGsn）和RNA的氧化代谢产物8-氧化鸟苷（8-oxo-7,8-dihydroguanosin，8-oxoGsn）的水平均随增龄而增加，其中以尿液中的8-oxoGsn增加最为显著，并且由于尿液样本很容易获得，因此推测尿液中的8-oxoGsn可以作为衰老的标志物。在人体中，患有心血管疾病的衰弱患者中，尿液中的8-oxoGsn与患者发生轻度认知障碍（mild cognitive impairment，MCI）独立相关，显示出87.5%的敏感性和69.5%的特异性，提示8-oxoGsn是早期筛查患有心血管疾病的虚弱患者MCI风险的一个有用指标。
不论是循环代谢物还是尿液中的代谢物，检测的技术水平和成本均较高，临床上较难推广。
推荐要点：
1. 循环CD8+CD28- T淋巴细胞亚群的增加反映机体的免疫衰老和慢性炎症状态，增加心血管风险（A级证据，IIa级推荐）； 2. 循环EPC水平的降低与衰老、内皮损伤和内皮功能障碍密切相关，是累积性心血管风险的有效生物标志物（A级证据，IIb级推荐）； 3. 多种DNAmAge模型均能较好的反映整个生命周期中的血液年龄进而影响及反映血管衰老的状况。但由于DNAmAge评估的技术难度和成本较高，较难推广（A级证据，IIb级推荐）； 4. 血液中的IGF-1蛋白、FGF21蛋白、Fibulin-1蛋白、HERVK-Env蛋白、ncRNAs及循环代谢物，血液中的EMPs；血液中IgG糖基化模式以及DNA甲基化水平和模式和尿液中的代谢物可能作为潜在的血管衰老标志物，但需要在后续的队列性研究中验证（C级证据，IIb级推荐）。 | 
发表于 2023-9-11 14:47:20