作者：王雪莹，李明，卢志明中华预防医学杂志, 2022,56(3) : 262-269.DOI：10.3760/cma.j.cn112150-20210916-00902
来源：CACLP体外诊断资讯
9月21日 世界阿尔茨海默病(AD)日
摘要 阿尔茨海默病（AD）是一种与年龄相关的神经退行性疾病，预计在未来几十年，AD的发病率将呈指数增长。AD生物标志物的临床应用和相关指南的制定经历了漫长的历程。目前，临床应用的AD临床诊断标准主要包括国际工作组织（IWG）制定的IWG-2标准，美国国立老化研究所-阿尔茨海默病协会（NIA-AA）制定的NIA-AA标准和中国老年保健协会老年痴呆及相关疾病专业委员会（ADC）发布的《中国阿尔茨海默病痴呆诊疗指南（2020年版）》。另外，除了已经确立的脑脊液中的核心标志物包括Aβ42、T-tau和P-tau，其他分子病理学途径中可作为诊断AD的标志物的研究在近十年来取得显著进步。本文分别就AD生物标志物应用指南与AD病理进程相关生物标志物的研究进展进行阐述。
阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是一种与年龄相关的最常见的神经系统退行性疾病。预计在未来几十年，AD的发病率将呈指数增长。截至2021年，我国有超过1 000万名AD患者，是全球AD患者数量最多的国家。有研究显示［1, 2, 3］，中国AD患者相关的人均经济成本（医疗成本、非医疗成本与间接成本）约为19 144美元，远高于癌症（2 022美元）和心血管疾病（13 408美元）。因此，AD将成为21世纪威胁我国人民生命财产安全及精神健康最严重的疾病之一。
目前认为，AD是一个从发生病理改变到出现临床症状的连续性疾病过程，病理生理改变在出现临床症状的15~20年前就已经开始［4, 5］。在诸多AD治疗的临床试验中，通常在轻微认知功能障碍（mild cognitive impairment，MCI）期进行干预被认为是较为有效的［6, 7］。因此，利用AD实验室诊断标志物开展疾病早期筛查对控制AD的发病率具有重要意义。
一、AD生物标志物应用指南的发展历程
01AD生物标志物的国际发展历程
AD生物标志物的临床应用和研究标准的制定经历了漫长的历程。1984年，美国国立神经病学与语言障碍、卒中和阿尔茨海默病及相关疾病协会（National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke-Alzheimer′s Disease and Related Disorders Association，NINCDS-ADRDA）制定了第一个可供临床应用的AD诊断标准，即NINCDS-ADRDA诊断标准。该标准根据患者的认知能力及行为学临床症状将AD分为3种临床诊断标准：有可能是AD（probably AD）、较大可能是AD（possible AD）、确诊为AD（definite AD）。其中“确诊为AD”需要在尸检后才能得到明确的诊断［8］。这一标准在临床上广泛应用了20多年。然而，由于缺乏特异的生物标志物，该标准较难将AD与其他痴呆症（例如路易体痴呆、额颞叶痴呆等）区分开［9, 10］。随着现代医学与科学技术的繁荣发展，例如基于结构性磁共振成像技术（structural magnetic resonance imaging，sMRI）［11］与正电子发射体层摄影技术（position emission tomography，PET）［12］的神经影像学的出现、脑脊液（cerebrospinal fluid，CSF）/血液/体液成分的精准分析等，一系列供临床诊断的AD生物标志物被发现并应用。2007年，国际工作组织（International Working Group，IWG）首次将生物标志物纳入AD的诊断标准，即IWG标准。其认定的生物学标志物主要有：海马、内嗅皮层、杏仁核体积的MRI（magnetic resonance imaging）影像学分析，脑脊液成分的异常（Aβ1-42的浓度降低，T-tau蛋白及P-tau蛋白浓度升高），氟脱氧葡萄糖-正电子发射断层（fluorodeoxyglucose-positron emission tomography，FDG-PET）的影像学分析［13］。随后，2011年，美国国立老化研究所-阿尔茨海默病协会（National Institute on Aging-Alzheimer′s Association，NIA-AA）基于以上两版诊断标准与当前的AD研究进展，将AD的发病过程更新为连续的3个阶段：临床前AD（preclinical AD）、轻微认知功能障碍（mild cognitive impairment，MCI）、老年痴呆（AD dementia），且每个阶段都具有相应的生物学标志物作为诊断标准［14］。2014年，国际工作组织将当前更新的生物标志物纳入到AD诊断标准，提出了IWG-2标准，同时扩充了AD的分类：即前驱期型AD（prodromal AD）、典型AD（typical AD）、非典型AD（atypical AD）、混合型AD（mixed AD）［15, 16］。然而，随着科学界对AD分子生物学机制的深入探究以及更多新型AD生物标志物的发现，NIA-AA于2018年提出了AT（N）研究框架。该框架中A指β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）的生物标志物，包括Aβ-PET阳性和脑脊液中Aβ42（Aβ42或者Aβ42/Aβ40比值）水平下降；T即微管相关蛋白Tau（microtubule-associated protein tau）蛋白的生物标志物，包括Tau-PET阳性和脑脊液P-tau（P-tau181或P-tau217）水平升高；N即神经变性或神经元损伤的生物标志物，包括sMRI成像上的脑组织萎缩、FDG-PET上的代谢降低和脑脊液总Tau蛋白以及神经丝轻链（neurofilament light chain，NfL）水平升高。其中，N指标不是AD的特异性指征，工作组认为同时出现“A”和“T”的生物标志物才能诊断为AD［17, 18］。
02AD生物标志物的国内发展历程
2012年8月，我国数十位中西医专家组成的中国痴呆临床实践指南工作组编著了中国第一部痴呆的中西医结合循证指南《中国痴呆诊疗指南》［7］。2018年5月26日，在首届中国脑病大会开幕式上，中国老年保健协会老年痴呆及相关疾病专业委员会（Alzheimer′s Disease Chinese，ADC）指南工作组正式发布了《中国痴呆诊疗指南（2017年版）》。2020年3月，ADC历时3年，召集了27个省市区163名神经科、精神科、脑病科、老年科、心理科、影像科、护理和养老领域的专家，发布了《中国阿尔茨海默病痴呆诊疗指南（2020年版）》。该指南根据证据和共识形成了17条主要推荐和42条次要推荐。该指南认为，脑脊液中Aβ42浓度降低、Aβ42/Aβ40比值降低、Tau或P-tau181浓度升高、P-tau181/Total-tau比值降低、Aβ42/Total-tau、Aβ42/P-tau比值降低或Total-tau/Aβ42、P-tau181/Aβ42比值升高，血浆中Aβ42浓度降低或Aβ42/Aβ40比值降低、Tau、P-tau181和P-tau217浓度升高均可作为AD诊断的生物标志物。此外，AD致病基因突变例如淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）、早老素蛋白1（presenilin 1，PSEN1）或早老素蛋白2（presenilin 2，PSEN2）有助于识别早发型、家族性AD［19］。易感基因突变例如APOEε4等位基因，有助于预测家族性AD及脑淀粉样血管病的发病风险［20］。
二、AD的生物标志物的研究进展
生物标志物可以反映病理过程或治疗干预后的药物反应。经典理论认为AD的病理过程主要有3种情况：（1）特定大脑区域的神经元丢失，特别是内侧和顶侧颞叶联合皮质；（2）神经细胞内神经纤维缠结，由聚集并缩短的和高磷酸化的Tau蛋白组成；（3）神经细胞外伴发神经炎症的斑块，主要由β淀粉样蛋白组成［21］。2016年3月，阿尔茨海默精准医学计划（Alzheimer′s Precision Medicine Initiative，APMI），在筛选了超过28 000份报告后，确定了1 404项基于血液的AD生物标志物的研究。根据生物标志物研究分类得到这样的结果：18%的研究基于传统的AD生物标记Aβ和Tau（或其相关肽、蛋白质或变体），19%的研究基于遗传标记，29%的研究方向是生物标志物，34%的研究与新兴分子病理学机制相关，包括炎症、免疫反应、氧化应激、DNA损伤、线粒体功能障碍和神经或微血管损伤等［22］。在此将从各个AD病理途径分别介绍相关生物标志物的研究进展。
01 Aβ蛋白相关生物标志物
Aβ蛋白是由跨膜蛋白Aβ前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）经过β分泌酶（beta-secretase 1，BACE1）与γ分泌酶依次水解产生的含有37~43个氨基酸的肽段［23］。其中Aβ40是最常的亚型，而Aβ42与Aβ43亚型水溶性较差，容易聚集形成寡聚体（Aβ oligomers）进而形成纤维（Aβ fibrils）或者斑块（Aβ plagues）［24］。Aβ级联假说认为这种寡聚体具有较强的神经毒性，可以诱发一系列的AD神经病理改变，包括Tau蛋白的过度磷酸化和聚集、小胶质细胞的激活［25］。
Aβ作为最主要的AD生物标志物得到了广泛的研究。2004年，Klunk等首先将Aβ结合PET对AD患者大脑进行成像，Aβ斑块在大脑内的时空分布从而得以可视化的检测。目前Aβ-PET病理学特征也用于临床上各个时期AD的评价指标［26］。多项研究表明脑脊液中的AD生物标志物可以在MCI阶段之前检测到，2016年Olsson等的一项meta分析表明，AD患者脑脊液中的Aβ42（而非Aβ40）相比正常人大概下降50%，且该指标早于Aβ-PET出现［27, 28］。由于Aβ42/Aβ40比值与临床数据更为接近，所以脑脊液中的Aβ42/Aβ40比值已被纳入临床生物标志物。尽管Aβ-PET与脑脊液生物标志物作为临床诊断指标更为精确，然而其对患者身体伤害性较强且费用较高，近年来，血液AD标志物作为更简单经济的生物标志物逐渐得到发展。2019年，Schindler等的血液质谱学数据验证了AD患者血液中的Aβ42/Aβ40比值变化同脑脊液及PET影像学数据变化一致，随后欧洲与美国将血液Aβ42/Aβ40比值也纳入到了AD生物标志物中［25］。Aβ在血液中会形成不同的聚集状态（例如二聚体、三聚体甚至纤维等）导致其蛋白性质不稳定，无法使用常规的检测血液标本方法（例如ELISA、Western blot），然而在检测试剂盒中加入一些稳定剂后则表现良好，例如QPLEXTM Alz plus assay试剂盒等［29］。Aβ血液标志物也同样可以指征AD的临床分期，有研究发现血液的Aβ42水平会随着患者认知能力的下降而下降［30］。除临床认可的Aβ生物标志物，Aβ信号通路中的某些关键蛋白也将会是AD潜在的生物标志物。多项数据证明，血浆中的BACE1有可能成为预测MCI进展到AD的生物标志物［31］。有研究者发现，脑脊液中的神经颗粒蛋白（neurogranin，Ng）与BACE1的比值可以区分具有相似认知缺陷的抑郁症和老年痴呆患者［32］。
02 Tau蛋白相关生物标志物
Tau是一类存在于神经元轴突中的微管结合蛋白，主要起着稳定微管的作用。Tau蛋白在细胞内易发生翻译后修饰，例如磷酸化、乙酰化、糖基化和泛素化等。Tau蛋白被磷酸化后极易发生聚集并与微管结合能力减弱，而后被释放到胞外域进入到突触与神经胶质细胞中，引发神经退行性疾病例如AD［33］。
Tau-PET与Aβ-PET同样是作为可视化的用于临床诊断的AD生物标志物［34］。但是，不同于Aβ在AD患者出现认知下降症状10~20年之前就已经在脑内聚集，Tau的聚集主要起始于轻微认知功能障碍（mild cognitive impairment，MCI）阶段并随着AD症状的发展而加重，所以Tau-PET只能用作AD患者的诊断而非预测［35］。脑脊液与血液中的T-tau（total-tau）含量也可以反映了神经变性的强度与神经元损伤的严重程度，是用于临床AD诊断的生物标志物之一［36］。目前有多种技术应用于检测血液中的Tau蛋白含量，例如超灵敏免疫检测技术、免疫磁减量技术（immune magnetic reduction，IMR）和Simoa（single-molecule array）检测技术等方法［37］。由于多种与认知障碍有关的神经退行性疾病都与T-tau的升高有关，所以T-tau并非AD的特异性标志。此外，大量研究证明脑脊液中P-tau181在AD患者中特异性的升高，目前被纳入AD脑脊液的特异性临床诊断标志物。Janelidze等［38］发现了血浆P-tau217在区分AD和其他神经退行性疾病方面的准确性可以达到89%~98%，比P-tau181蛋白更为准确，但目前尚未进入临床诊断标准。此外，神经来源的外泌体中的T-tau或P-tau也具有作为血液生物标志物的潜能，但还需要进一步的研究来验证［39］。
03神经退化相关生物标志物
神经退行性病变主要包括轴突的退化及突触的丢失，临床上表现为大脑灰质体积与皮层厚度的降低以及海马体的损伤［40］。FDG-PET通过反应突触葡萄糖代谢水平，被用于作为诊断神经元活性的分子影像学生物标志物［34］。越来越多的证据表明，AD患者的记忆损伤开始于海马区突触功能受损，突触功能障碍和退化可能是AD患者认知能力下降的直接原因［41］。T-tau蛋白是AD轴突变性或损伤的通用标志物。Marklund等［42］证明，AD患者的脑脊液中T-tau浓度升高，且浓度越高神经变性过程越强烈。此外，也有研究表明通过定量分析脑脊液中的视锥蛋白样蛋白1（visinin-like protein 1，VLP-1）与脂肪酸结合蛋白（fatty acid-binding protein，FABP）可以反映轴突损伤的程度，二者都在神经元中富集，但与AD的相关性不如T-tau［43］。NfL是髓鞘轴突中含量最多的成分之一，当轴突神经炎退化后，NfL将被释放到脑脊液与中枢循环系统中［44］。多项研究证明在患者的认知能力下降初期，脑脊液中NfL水平就已经升高，因此NfL未来可发展成为预测临床前AD（preclinical AD）症状的指标［45］。NfL在其他神经退行性病变中也同样出现变化，所以该指标不具备AD诊断特异性，需要与Aβ/Tau生物标志物联合应用于AD的临床诊断与预测。神经颗粒蛋白Ng（neurogranin，Ng）可参与突触可塑性功能的调节。目前有多项证据表明，Ng在脑脊液中增加的幅度与MCI期认知能力下降、脑萎缩和葡萄糖代谢减少的严重程度存在定量相关，并且有极高的鉴别诊断价值［46］。突触前末端的SNARE复合物蛋白，例如突触体相关蛋白SNAP25、突触融合蛋白SYT1，均为驱动神经递质胞外膜融合的关键组成部分［47］。AD脑皮质区SNAP25和SYT1蛋白水平的降低反映了AD突触退行性变和缺失。此外，ras相关蛋白RAB3A也将有望成为突触缺失和功能障碍的标志物，但是还需更多的实验证实［48］。α-突触核蛋白（α-synuclein）、TDP43蛋白在例如帕金森病（Parkinson′s disease PD）、路易体痴呆以及AD等多种退行性疾病中均发生病变，也将有望应用于AD的临床诊断与预测［49, 50］。由于中枢神经系统存在血脑屏障，且血液成分复杂，故目前尚未出现可供临床使用的与神经退化相关的血液生物标志物。
04神经炎症相关生物标志物
神经炎症（neuroinflammation）是中枢神经系统产生的免疫应答反应，主要由神经元、星形胶质细胞（astrocytes）与小胶质细胞（microglia）所介导［51］。星形细胞为神经元提供营养，构成血脑屏障的一部分，参与中枢神经系统损伤后的修复机制；小胶质细胞是大脑中固有的巨噬细胞，与中枢神经系统主动免疫防御功能密切相关。大多数情况下，这两种类型的细胞都是平行激活的，胶质细胞激活与神经元功能缺陷与AD突触可塑性有关［51, 52］。Ⅱ型髓系细胞触发受体（triggering receptor expressed on myeloid cells 2，TREM2）的变异体与AD的发病相关，该基因在中枢神经系统的小胶质细胞上选择性表达。有研究发现，AD患者的脑脊液中可溶性髓样细胞触发受体（soluble triggering receptor expressed on myeloid cells 2，sTREM2）的浓度升高，且与T-tau和P-tau浓度升高有关［53］。另外，星形胶质细胞、小胶质细胞分泌的蛋白在AD患者脑脊液中也被发现升高，例如包括壳三糖酶、CD14、YKL-40等［54］。免疫反应和胶质活化的细胞因子或趋化因子，包括IL-1β、IL-2、IL-6、IL-18、趋化因子配体-10、TNF-α转化酶、TNF受体和干扰素（interferon，IFN-γ）等，以及两种急性期蛋白包括α1-抗胰糜蛋白酶（α1-antichymotrypsin，α1-ACT）和高敏感性C-反应蛋白（high sensitivity C-reactive protein，hsCRP）也均在AD患者中发生异常［55］。此外，外周血中固有免疫细胞的激活状态也可能是对大脑产生影响的早期生物标志物，这些细胞包括中性粒细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞和自然杀伤（natural killer，NK）细胞［56］。
05氧化应激相关生物标志物
氧化应激反应产生的高活性自由基会破坏核酸、蛋白质和脂质，这种变化通常发生在神经炎症之后，被认为是神经元损伤的直接原因。同型半胱氨酸有望成为AD诊断的生物标志物，它的升高直接导致氧化应激，并参与血脑屏障功能障碍、心脑血管疾病、神经元死亡、Aβ生成和沉积以及Tau蛋白磷酸化等病理过程。多项研究表明，血液中同型半胱氨酸水平升高与AD的发病率有关。据报道，AD和MCI患者血液中抗氧化剂含量降低，包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、硒、维生素E等。与对照组相比，AD和MCI患者的自由基、蛋白受损、脂质过氧化和核酸氧化的生物标志物均有所增加，其中主要包括血红素氧合酶1、蛋白质碳基、氧化蛋白产物、丙二醛和氢过氧化物等［57, 58］。
06MicroRNAs
MicroRNA（miRNA）是一类由内源基因编码的长度为18~25个核苷酸的非编码单链RNA分子。miRNA通过结合于mRNA 3′非编码区在转录后水平调控基因的表达，目前已有数据证明某些miRNA对APP或BACE1基因的转录后调控与AD的病理发生相关［59, 60］。由于miRNA的异常变化与AD神经生物学信号通路中的表观遗传学有关，它们已被认为是AD诊断、疾病预测、预后和治疗的候选生物标志物［61］。2019年Takousis等对147项数据中AD患者大脑、血液和脑脊液中的miRNA进行了Meta分析，该数据发现AD患者中有57种miRNA具有显著差异，其中有5种差异最为明显：hsa-miR-181c-5p与hsa-miR-29c-3p在AD患者中表达均上升，hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-146a-5p与hsa-miR-223-3p表达则下降［62］。本课题组前期对28位受试者（6例轻度AD、7例中度AD、6例重度AD、9名健康对照者）的血清进行高通量测序，筛选出了13个表达差异的miRNAs。随后笔者对207份血清样本（早期AD31例、中期AD52例、晚期AD38例、健康对照86名）通过qRT-PCR验证测序所筛选出的miRNAs，最终筛选出9种较为特异的miRNAs，其中hsa-miR-22-3p在血清中高度表达并且具有更高的灵敏度和特异性，因此，笔者认为hsa-miR-22-3p具备作为诊断早期AD的生物标志物的潜力［63］。
结语与展望
众多研究表明，通过对AD病理生理进程的分子机制上的深入探究（例如如突触功能障碍、神经炎症和氧化应激等）将有助于开发AD生物标志物。目前，与轴突损伤、突触功能障碍相关的生物标志物的早期诊断和预后价值已经得到证实，例如神经颗粒蛋白Ng（neurogranin，Ng）在鉴别AD和其他神经退行性病变时有特异性。NfL特异性相对较差，然而其对于预测疾病进展和跟踪疾病严重程度效能良好，所以NfL与AD特异性生物标物的联合应用具有广泛前景。
神经胶质细胞活化被认为是AD病理生理学的主要组成部分。脑脊液中sTREM2和YKL-40水平对早期AD诊断有帮助。然而，它们对AD的特异性存在着争议。特别是sTREM2水平随临床分期的动态变化，使得其价值不明确。在纵向评估过程中，一方面，生物标志物的病程阶段依赖性变化普遍存在于突触损伤相关生物标志物中，使其临床应用复杂化；另一方面，这些变化提供了可用于疾病分期和跟踪的线索。此外，考虑到这些病理机制与AD发病密切相关，可以作为AD修饰疗法的候选靶点。在获得更多实验证据后，这些生物标志物有望在未来发挥作用。
对AD进展不同阶段的分子病理生理学机制的研究和生物标记物的开发将为更准确、个性化的生物标记靶向治疗奠定基础，进一步推动精准医疗。在过去的十年里，AD生物标志物的研究得到了显著发展。已确立的核心标志物包括脑脊液中的Aβ42（Aβ42/Aβ40比例）、T-tau以及P-tau，其经过数百个实验室重复验证得到了一致认可。目前关于新兴生物标志物的临床应用需要经历一个标准化的过程，包括独立的、大规模的验证研究（可以借鉴生物标志物A/T/N分类系统）、不同实验室操作流程的标准化、以及商业开发过程中的成本最优化设计。此外，通过对血液中可用作初级筛查的AD生物标志物（尤其是可用作早期诊断的生物标志物）的标准化设计和开发，进而建立一个多阶段的诊疗模式，将具有深远的价值和意义。 | 
发表于 2023-9-22 15:51:54