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DNA甲基化检测助力妇科肿瘤精准诊断

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发表于 2023-9-26 14:33:10 | 显示全部楼层 |阅读模式

来源:同济大学学报医学版、全国体外诊断网 CAIVD


肿瘤的发生发展过程存在广泛的遗传变化和相关基因的功能及活动失调[1]。在癌症中发现DNA甲基化异常已有40余年,研究发现其对基因表达、基因组稳定性和肿瘤发生发展具有重要的作用。

DNA甲基化检测样本易于从组织、血液、尿液、胸腹水和痰液中获得,检测方法具有灵敏度高、稳定性佳和成本低的特点,作为新型的生物标志物被广泛应用于各种恶性肿瘤的早期诊断,包括肺癌、消化道肿瘤、胶质瘤和妇科肿瘤等[2-3]。DNA甲基化结合其他临床诊断指标,在恶性肿瘤的诊断中发挥越来越重要的作用[4]。

限于篇幅,本文主要就DNA甲基化的生物学特征和作用机制、检测方法以及在女性生殖系统肿瘤中的临床应用价值进行评述,以提高DNA甲基化检测对妇科肿瘤精准诊断的水平。

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1、DNA甲基化的概念及生物学功能

甲基化属于表观遗传学修饰,是在DNA序列不变的情况下,调节基因的表达和关闭,维护染色体的完整性,以调节DNA重组和某些特定基因组区域的转录活性,与人类发育和肿瘤发生密切相关。S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体,在DNA甲基转移酶催化下,胞嘧啶环上5′位置的氢被活性甲基所取代,转变成5-甲基胞嘧啶(5mC)[5],即DNA甲基化。甲基化所引起的原癌基因表达激活与抑癌以及修复基因表达失活导致肿瘤的发生[6]。肿瘤细胞甲基化的特点是:癌细胞的全基因组水平处于低甲基化状态(比正常低20%图片60%),发生在癌症早期,并且与肿瘤的严重程度和转移有关[7];抑癌基因、DNA修复基因启动子区域CpG岛高度甲基化,特定基因启动子区域异常的高甲基化可以导致染色体结构的改变,从而致使基因沉默,是恶性肿瘤中表观遗传学特征之一。DNA甲基化贯穿整个肿瘤发生发展的过程,甲基化相关酶的突变也可能引起肿瘤的发生,启动子区域甲基化情况的检测可作为肿瘤前期筛查和预后的一项临床指标[8]。目前为止,已有明确研究表明DNA甲基化可用于乳腺癌、结肠癌、肝癌、胃癌、肺癌、胶质瘤等肿瘤的诊断,准确率高达95%,在协助妇科肿瘤的诊断上也显示了很好的应用前景,这些进展为肿瘤的早筛和预防提供了新方法[9]。

2、DNA甲基化检测的方法

DNA甲基化检测已是成熟的分子病理学技术,分为检测整体基因组和特定基因位点两种。前者有变性高效液相色谱法、SssI甲基转移酶法、基于抗5mC的免疫化学法等;后者有Southern印迹杂交法、焦磷酸测序法、重亚硫酸氢钠修饰后测序法、甲基化特异性PCR法和亚硫酸氢钠联合限制性内切酶分析法等[10]。根据样本DNA预处理的方法不同,也可将DNA甲基化检测方式分为3类:亲和富集预处理法、限制性酶切预处理法与亚硫酸氢盐处理法[11]。由于前两种预处理法的某些不足,通过亚硫酸氢盐预处理法进行的DNA甲基化检测与分析是目前的主流方法,常用的有甲基化特异性数字PCR(methylation specific PCR, MS-PCR)、甲基化荧光法(MethyLight)、核酸质谱、甲基化芯片等。基于PCR扩增的亚硫酸氢盐预处理法不需要昂贵的设备,方法简便易行,有基因扩增室的单位都能开展。

3、DNA甲基化检测在肿瘤诊断中的应用

3.1 泛癌种早筛检测

液体活检血液标本被证明含有肿瘤的遗传物质且可以被检测,循环肿瘤DNA(ctDNA)的基因组谱已被证明与相应肿瘤的基因组谱密切匹配,具有协助肿瘤的精准诊断价值。通过液体活检进行多癌种早期筛查和风险评估是DNA甲基化检测的重要应用领域之一。2016年1月,测序巨头Illumina公司宣布投资1亿美元成立GRAIL公司,目的是希望通过血液检测来实现癌症早期筛查。GRAIL投入重金先后进行4项大型临床研究,重点关注肿瘤早期筛查,分别为CCGA、STRIVE、SUMMIT、PATHF-IDER。PATHFINDER计划(NCT04241796)是2019年12月启动,此项目为前瞻性干预临床试验,招募受试者大约6 200例,均为尚未诊断为肿瘤的50岁以上高危人群,通过比较其多癌种早筛产品Galleri检测结果和金标准检测结果,来评估Galleri产品在真实的癌症早筛场景中的检测性能。从上述的研究中GRAIL积累了庞大的样本数据库,建立和持续优化检测标准和算法。大样本和长周期的前瞻性研究为其癌症早筛产品提供了真实世界的研究评估数据。GRAIL公司在2021年美国临床肿瘤年会(American Society of Clinical Oncology, ASCO)年度大会上公布了其用于多癌种早筛产品Galleri首批临床数据(PATH-FINDER计划)。Galleri是一项基于血液cfDNA靶向甲基化检测的分析方法,可检测、区分临床分期的50多种癌症类型,检测多种癌症的同时可识别其起源的组织。在5 000多例的检测样本中,Galleri的总体检测灵敏度为51.5%。随着癌症患者临床分期的升级Galleri的灵敏度也稳步提升,其 Ⅰ 期患者检测灵敏度为17%,Ⅱ期为40%,Ⅲ期为77%,Ⅳ期为90%,其检测的特异性最终达到99.4%。此外,Galleri对于癌症的组织溯源定位非常的精准,可达到88.7%的准确性[12]。目前,Galleri已被美国食品和药品监督管理局(Food and Drug Administration, FDA)批准为“突破性设备”。虽然该测试还未获得FDA全面批准上市,但多个地区已准予该测试在50多家医院和1 100 余家诊断机构使用。

3.2 特定癌种检测

DNA甲基化具有组织的特异性,这是异常甲基化基因检测能助力肿瘤诊断的基础,也是精准诊断的需要。目前已经用于临床的血Spetin9基因甲基化检测,具有较高的灵敏度和特异度,可辅助结直肠癌的诊断。乳腺癌患者中RASSF1A、SOX17、p16、CDH1、CyclinD2和RARβ2基因启动子区域都存在高甲基化状态。p16基因启动子区域的甲基化检测可作为胰腺癌早期筛查的潜在标志物[13]。通过特定癌种开发的cfDNA/ctDNA的异常甲基化检测有望在肿瘤的精准诊断和个体化治疗中发挥越来越重要的作用。

截止2021年12月31日,获得中国国家药品监督管理局试剂盒注册证的基因甲基化产品共有9个,其中包含1个胶质瘤的MGMT基因甲基化检测试剂、1个肺癌SHOX2与RASSF1A基因甲基化检测试剂、1个胃癌血液RNF180与Septin9基因甲基化检测试剂、3个结直肠癌血液Septin9基因甲基化检测试剂、2个结直肠癌粪便SDC2基因和1个结直肠癌粪便FIT-DNA多靶点检测试剂盒。此外,在肝癌、食管癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌等亦在临床验证阶段,临床的应用指日可待。

3.3 在女性生殖系统肿瘤诊断中的应用

3.3.1 内膜癌甲基化基因检测

随着肥胖和寿命的增加,子宫内膜癌的发病率不断上升。宫腔镜获取子宫内膜组织进行组织病理检查是内膜癌诊断的金标准,但是这种创伤性检查除了给受检者带来不适外,由于取材的局限性,组织病理学诊断的结果常常受到取材的部位、样本的大小和质量的影响,客观上要求通过相应的分子病理学检查提高诊断尤其是早期诊断的准确性。研究发现,常规宫颈刷获得的细胞样本中亦可发现子宫内膜癌细胞,这种微创细胞学标本可以进行DNA甲基化检测协助内膜癌的诊断[14-15]。目前已经发现一些内膜癌甲基化基因的特异性达到了85%以上,包括ADCYAP1、ASCL2、BHLHE22、CDH13、CDO1、CELF4、GALR1、HAND2、HS3ST2、HTR1B、MAGI2、MME、POU4F3、RASSF1和ZNF662,AUC值范围从0.80到0.96。目前单个DNA甲基化基因检测的灵敏度还不足以用作筛查试验,高甲基化基因的组合以及DNA甲基化和其他方法的组合能提高检测的灵敏度和特异度[16-18],为内膜癌检查提供一种有用的方法。多基因组合包括CDO1/CELF4、BHLHE22/CDO1/CELF4、HLHE22/CDO1/HAND2、BHLHE22/CDO1/TBX5、CADM1/MAL/miR124-2、HOXA9/RASSF1/HTR1B、甲基化(BHLHE22、CDO1、TBX5和HAND2)与PTEN和TP53的突变相结合,其灵敏度为60.0% 图片91.8%,特异度为70% 图片100%。对于微创标本甲基化标记物检测内膜癌的作用目前尚有不一致的研究结果,由北京协和医院牵头的全国16家医院开展“基于宫颈细胞学CDO1/CELF4甲基化的内膜癌早筛早诊多中心对列万人研究(EndoMethy)”将成为全球最大人群内膜癌甲基化临床研究,其结果有望为内膜癌早筛提供临床价值的真实世界。

3.3.2 卵巢癌甲基化基因检测

尽管卵巢癌的发病率低于宫颈癌和子宫内膜癌,居妇科恶性肿瘤第3位,但死亡率却高于宫颈癌及子宫内膜癌。究其原因,卵巢癌起病隐匿,临床症状缺乏特异性,难以早期发现;此外缺乏有用的肿瘤标志物,临床使用的检查和诊断方法有限,灵敏度和特异度不高,导致大多数卵巢癌患者确诊时已经处于中晚期,且疗效不佳[19]。卵巢癌起源于卵巢表面的生发上皮具有分化的潜能,因此卵巢癌具有分子异质性,从而导致其诊断的复杂性[20-23]。DNA甲基化检测辅助卵巢癌的早期诊断显示了较好的应用前景,一项宫颈刮片研究发现,AMPD3、NRN1和TBX15甲基化组合的灵敏度为61%图片76%,特异度70%图片88%。HOXD9、FOXA1、RASSF1A、ADAMTS1和BNC1、CDO1、APC甲基化,其灵敏度与特异度皆提示其可发展成为新的微创卵巢癌筛查标志物[24-27]。有学者主要用晚期卵巢癌组织样本研究,结果显示BRCA1、MLH1等10个基因甲基化高表达,基因组合后的灵敏度和特异度分别为69%和70%,对于早期卵巢癌的诊断价值尚不清楚[28]。在临床工作中,考虑到获取卵巢肿瘤样本的难度,目前在血液样本筛查卵巢癌相关ctDNA甲基化基因取得了可喜的进展:Melnikov等[28]的5基因(BRCA1、HIC1、PAX5、PGR、THBS1)研究,Zhang等[29]的7基因(APC、RASSF1A、CDH1、RUNX3、TFPI2、SFRP5、OPCML)研究,显示卵巢癌ctDNA甲基化检测的灵敏度均在85%以上,特异度在60%图片90%。现存的主要问题一是缺乏早筛特异的单个标志物,二是cfDNA含量较低,影响检测的稳定性和灵敏度[30]。基于基因组甲基化产生的甲基化单倍型区块(methylation haplo-type block, MHB)技术方兴未艾,具有早筛和组织溯源的特点,有望使cfDNA甲基化检测的灵敏度大大提升[31]。

3.3.3 宫颈癌甲基化基因检测

宫颈癌DNA甲基化基因是妇科肿瘤研究最成熟的生物标志物,目前应用最多的基因包括POU4F3、PAX1、JAM3、C13ORF18、TERT、ANKRD18CP、CDH6、GFRA1、ASTN1、DLX1、ITG4、RXFP3、SOX17、ZNF671、LHX8、PCDHA4、PCDHA13、SOX1和ZNF582,以及多基因组合的PAX1/JAM3、FAM19A4/miR124-2、CADM1/MAL/miR124-2、与体基因联合人类乳头瘤病毒(human papilloma virus, HPV)甲基化的EPB41L3+HPV(HPV16L1、HPV16L2、HPV18L2、HPV31L1和HPV33L2)等,在宫颈刮取细胞检测皆有80%以上准确性[32-33]。双基因可达到更佳临床结果与成本控制等转化优点,更多的基因由于临床判读复杂性与通路信号重迭等因素,其临床效果需更多证据;在HPV相关研究中发现,当PAX1/ZNF582联合HPV16/18检测可将阴道镜检查的患者数量减少31.3%,从而在阴道镜检查不易获得的地区提供可行的随访解决方案[34-35]。此外,连接黏附分子3(JAM3)通过细胞间的黏附及相互作用,调节肿瘤细胞生长,能够显著提高特异度和阳性预测值,在临床中验证EPB41L3/JAM3甲基化与高危型HPV(hrHPV)检测具有相似的阳性预测值(分别为0.930和0.954,P=0.395)并显著高于单独的细胞学检查,其可用于与HPV联合筛查或分流HPV阳性患者[36]。PAX1/ZNF582与PAX1/JAM3甲基化与HPV16/18联合检测可作为进一步阴道镜检查的参考,提高宫颈病变筛查的准确性并避免反复阴道镜检查与妇女罹癌恐慌。例如,对于hrHPV阳性患者,如果甲基化阴性,可以随访暂时不做阴道镜活检,反之要及时行病理学检查明确瘤变的存在。概括甲基化检测在宫颈病变的临床应用主要是[34-39]:(1) hrHPV阳性患者进一步检查的分流;(2) 对ASC-US/鳞状上皮低级别病变(low-grade squamous intraepithelia, LSIL)细胞学检查的患者进行CIN3阳性分流;(3) hrHPV阳性育龄妇女的管理;(4) 停经后妇女筛查避免宫颈萎缩的漏诊管理;(5) 退出筛查计划女性的退出测试等。DNA甲基化对于检出HSIL阳性有潜在作用,与HPV检测的内容不同,联合检测可以提高液基细胞学诊断的水平,对宫颈瘤变和宫颈癌的精准诊断具有重要的临床意义。

4
展望

在过去的十余年中,基于DNA甲基化的生物标志物在临床的开发和应用取得了长足的进步,在早期诊断、预后评估和疗效监测等方面显示出良好的应用前景。DNA甲基化协助肺癌、结肠癌和胶质瘤的诊断已经用于临床;肝癌、食管癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌等亦在临床验证阶段,作为一种肿瘤无创诊断的新方法受到欢迎。尽管如此,在DNA甲基化的研究和临床转化、尤其是在妇科肿瘤方面需要进一步加强。针对存在的问题和不足,未来研究的重点是:具有肿瘤组织特异性的DNA甲基化基因的筛选,多甲基化基因的组合检测和提高检测的灵敏度,微创样本和血液ctDNA甲基化检测的开发使用,临床与病理多学科参与的甲基化检测临床转化试验等。血浆ctDNA甲基化单倍型分型技术方兴未艾,是一种用于肿瘤早筛和组织溯源、连续监测肿瘤进展和多器官转移的有效技术。毋庸置疑,DNA甲基化检测将在助力肿瘤的精准诊断和个体化治疗上发挥越来越大的作用。

参考文献略
引用本文:蒋铭华,易祥华.DNA甲基化检测助力妇科肿瘤精准诊断[J].同济大学学报(医学版),2022,43(6):757-762.
作者:蒋铭华1, 易祥华2
1. 复旦大学附属闵行医院,上海市闵行区中心医院妇产科
2. 同济大学附属同济医院病理科

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