小科普：PCR和qPCR

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核酸检测试剂是分子诊断领域非常重要的部分，在疫情之前很少有人去关注PCR原料部分，而这一块也是长期被国外的公司所占据，但是疫情期间受到产能、运输等影响，国内的PCR原料企业异军突起。

PCR/qPCR的优势？

目前PCR类研究占据目前分子诊断的主要市场的原因在于其产品灵敏度高、特异性强、诊断窗口期短，可进行定性、定量检测，可广泛用于肝炎、性病、肺感染性疾病、优生优育、遗传病基因、肿瘤等，填补了早期免疫检测窗口期的检测空白，为早期诊断、早期治疗、安全用血提供了有效的帮助。

PCR/qPCR实验中最需要注意什么？

PCR/qPCR的反应五要素为：酶，dNTPS，Mg2+ ，引物，核酸 ；酶链反应，是五要素中最为重要的一项，因此聚合酶的选择也是重中之重。先给大家看一个正常的扩增体系应该是什么样的：

引物
引物长度一般为15~30bp，引物3’末端最好选用A、C、G，引物G+C约占45~55%，避免引物内的发卡结构和引物间二聚体，不能与非目的扩增区有同源性。

探针
Taqman 探针设计的原则

dNTPs

具有较强的酸性，其储存液一般用NaOH调pH至7.0~7.5，一般存储浓度为10mM，各成分等量配置，反应浓度为20~200uM

BSA
乙酰化的BSA，减少PCR管对Taq酶的吸附作用，对Taq酶有保护作用


PCR Enhancer
PCR增强剂是一种由多种成分组成的混合添加剂，在PCR反应中，PCR Enhancer能够有效降低高GC模板和具有复杂二级结构模板的解链温度，极大地减少DNA二级结构对PCR的影响，增加PCR反应的灵敏度和特异性，且兼容几乎所有DNA聚合酶的扩增体系。
主要是由DMSO、Betaine、甲酰胺、TMAC、Trehalose、BSA、Tween-20、NP-40、TritonX-100、PEG、亚精胺、甘油、单链DNA结合蛋白或其混合物组成.


聚合酶

（1）热启动Taq DNA聚合酶分为化学修饰的DNA聚合酶、适配体修饰的DNA聚合酶、抗体修饰的DNA聚合酶等。

（2）高保真Pfu聚合酶保真性是普通Taq酶的N倍热稳定的Pfu酶，可产生长达5 kb的钝端扩增子具有3 ' - 5 '校正外切酶活性，错误率为3.0 x 10-6 （3）BST酶BST 2.0 和BST DNA聚合酶大片段适用于60~65度等温扩增（LAMP）BST3.0 在60~65间具有很好的逆转录活性，可用于单管T-LAMP （4）RPA酶重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37°C左右。 （5）TTH 聚合酶兼具DNA聚合酶和逆转录酶活性Tth DNA 聚合酶是一种热稳定性酶，分子量为 92kDa ，从 Thermus thermophilus HB-8 中分离。在 74℃ 时可进行 DNA 复制，在 95℃ 的半衰期为 20 分钟。 Tth DNA 聚合酶在镁离子存在的条件下可催化核苷酸沿 5'—3' 方向发生聚合反应，形成双链 DNA ，也可在镁离子存在的条件下，以 RNA 为模板沿 5'—3' 方向发生核苷酸聚合反应。 该酶也具有5'－3'外切酶活力，无3'－5'外切酶活力， 可用于实时荧光 PCR 。能在较高的温度下进行逆转录，增加了引物杂交和延伸的特异性；减少了由于 RNA 二级结构引起的问题。 （6）逆转录酶反转录酶(reverse transcriptase,也可写成逆转录酶) 又称为依赖RNA 的DNA 聚合酶。1970 年Temin 等在致癌RNA 病毒中发现了一种特殊的DNA 聚合酶，该酶以RNA 为模板，以dNTP 为底物，tRNA( 主要是色氨酸tRNA) 为引物，在tRNA 3'-OH 末端上，根据碱基配对的原则，按5'-3'方向合成一条与RNA 模板互补的DNA 单链，这条DNA 单链叫做互补DNA (complementary DNA，CDNA)。



除了上述的必备成分之外，在PCR试剂原料中还有一些特殊的存在，这些特殊的存在能够使得PCR反应或者相关的操作有一个较大的优化，比如：

1）直接扩增预混液（耐抑制的qPCR/RT-qPCR预混液）

强大的扩增能力和抗抑制能力

样品免提取：适用于唾液、血液、尿液、粪便等原始样品

简单的单管反应液，只需要添加引物，探针和 检测样本

适用于检测RNA和DNA病原体的单重和多重检测

2）防止气溶胶和环境污染的预混液：

含有dUTP使扩增子易被UDGase降解

添加dUTP，U:A:C:G= 2:1:1:1

也可在A:T:C:G 等比例的情况下额外添加U，U:T=2:1 or 3:1

联合尿嘧啶DNA糖基酶UDGase（0.01- 0.04 U/μL ）共同使用

适用于开放式、自动化、高通量仪器的多重检测

3）可冻干的预混液和酶

分子诊断试剂正逐步向冻干的方向发展，其优势包括可常温运输和储存，更长的保质期，样本体积更灵活。

为了可兼容冻干，酶制剂必须是无甘油且含有特殊的冻干赋形剂， 从而在各种冻干条件下（包括冷冻、温度梯度、真空和脱水）可保证混合物稳定性。

理想的冻干配方可保证酶在冻干形式下的稳定性，以及酶制剂在快速水化和激活后的性能不受影响

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